| 1 |
1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. |
Исследование физико-химических характеристик полиплексных наночастиц и механизмов их транспорта и диссоциации в клетках-мишенях |
| Результаты этапа: В настоящей работе мы определили характеристики полиплексов на основе конъюгатов ПЭИ-ПЭГ-ТАТ, их внутриклеточное поведение на различных клеточных линиях и их связь с эффективностью трансфекции. Нами была синтезирована панель различных конъюгатов ПЭИ-ПЭГ-ТАТ и на основе этих конъюгатов получен набор из 20 различных по составу полиплексов и исследована трансфекция 11 клеточных линий полиплексами с различными конъюгатами и отношениями конъюгат/плазмида (N/P). Варьируя соотношения ПЭГ/ПЭИ и N/P мы обнаружили соотношения, при которых наблюдается высокая эффективность трансфекции, до 100% на ряде клеточных линий.
С использованием гепарина и ДНКазы I показано, что полиплексы модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ) и ТАТ-пептидом (ПЭИ-ПЭГ-ТАТ) эффективнее компактизуют и лучше защищают ДНК от ферментативной деградации, чем полиплексы на основе немодифицированного ПЭИ.
Мы применили оригинальный подход к анализу распределения полиплексов, полученных методом атомно-силовой микроскопии, который позволил: 1) учесть уширение размеров полиплекса за счёт зонда используемого кантилевера, что позволило определить эффективные размеры; 2) выявить фракцию наночастиц с диапазоном эффективных (реальных) размеров 50-75 нм, наилучшим образом коррелирующую с трансфекцией, но не обнаруживающуюся методом динамического светорассеяния.
Нами было показано, что различия в максимальном проценте трансфекции различных клеточных линий обусловлены различиями в процессе внутриклеточного транспорта, тогда как максимальная эффективность трансфекции различалась и варьировала на разных клеточных линиях от 4,4 до 100%.
Используя конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и метод FRET (безызлучательный резонансный перенос энергии по Фёрстеру), мы провели подробную характеристику проникновения меченых квантовыми точками (плазмидная ДНК) и AlexaFluor647 (блок-сополимер ПЭИ-ПЭГ-ТАТ) полиплексов в опухолевых клетках, а также их распаковки в различных клеточных компартментах. На основании полученных экспериментальных данных нами были разработаны модели: 1) характеризующие различные стадии многоступенчатого процесса трансфекции одними и теми же полиплексами клеточных линий, существенно различающиеся по максимально достигнутому проценту трансфекции: А549, Calu-1 и М3 (17,7, 63,2 и 98,0% соответственно); 2) хорошо описывающие экспериментальные данные для использованных линий клеток А549 (r = 0,975), Calu-1 (r = 0,833) и M3 (r = 0,941). Мы обнаружили отрицательную корреляцию между обратной скоростью входа полиплексов в клетку и максимально достигнутой эффективностью трансфекции на разных клеточных линиях (r = -1, р = 0,0016). Нами выявлена отрицательная корреляция между константой скорости распаковки в эндосомах/лизосомах и максимально достигнутой эффективностью трансфекции на разных клеточных линиях. (r = -0,997, р = 0,05). |
| 2 |
1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. |
Исследование физико-химических характеристик полиплексных наночастиц и механизмов их транспорта и диссоциации в клетках-мишенях |
| Результаты этапа: Нами были созданы новые лигандированные полиплексы на основе блок-сополимеров ПЭИ-ПЭГ-пептид, с пептидом МК1С, несущим последовательность, являющуюся специфическим лигандом к меланокортиновым рецепторам первого типа, сверхэкспрессированных на поверхности клеток меланом. В данной работе была исследована трансфицирующая активность лигандированных полиплексов различного состава по сравнению с нелигандированными аналогами. Лигандированные полиплексы на основе ПЭИ-ПЭГ-МК1С, приготовленные при соотношениях азота блок-сополимера к фосфатам ДНК N/P 20-30, показали более высокую эффективность по сравнению с полиплексами на основе ПЭИ-ПЭГ. Свободный лиганд к меланокортиновым рецепторам первого типа, альфа-меланоцитстимулирующий гомон?(альфа-МСГ), добавленный к клеткам в избытке, приводил к снижению эффективности трансфекции лигандированным полиплексом до уровня, характерного для полиплекса без лиганда. При трансфекции лигандированными полиплексами клеточной линии HEK293, на которой отсутствуют меланокортиновые рецепторы первого типа, конкуренция со свободным альфа-МСГ не приводила к снижению трансфекции ПЭИ-ПЭГ-МК1С. Эти данные свидетельствуют также о рецептор-зависимом входе лигандированных полиплексов в клетки-мишени с повышенной экспрессией меланокортиновых рецепторов.
С помощью метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с применением технологии резонансного переноса энергии по Фёрстеру (FRET), а также разработанных нами математических моделей мы исследовали кинетику внутриклеточного транспорта и распаковки наночастиц полиплексов на временах до 8-10 часов после трансфекции. Мы обнаружили ряд отличий в кинетике внутриклеточного транспорта лигандированных и нелигандированных полиплексов. Запакованные лигандированные полиплексы накапливаются в клетках меланомы быстрее чем распакованные полиплексы, для нелигандированных полиплексов мы показали наличие временной задержки входа в клетку. Это может приводить к преимущественной распаковке нелигандированных полиплексов на клеточной поверхности с последующей интернализацией полиплексов в распакованном или перепакованном (с заменой синтетического поликатиона на природный) состоянии, что может негативно сказаться на эффективности трансфекции. Кроме того, лигандированные конъюгаты обеспечивают более быстрое поступление переносимого генетического материала в клеточное ядро по сравнению с нелигандированными полиплексами. Такие различия в поступлении, внутриклеточном транспорте и распаковке полиплексов в клетках, могут обуславливать более эффективную трансфекцию лигандированными (ПЭИ-ПЭГ-МК1С/ДНК) полиплексами по сравнению с нелигандированными (ПЭИ-ПЭГ/ДНК) аналогами.
Мы также исследовали мембранолитические свойства полиплексов, поскольку выход полиплексов из эндосом является одним из важнейших этапов их внутриклеточного транспорта. В качестве модели мы использовали липосомы, нагруженные флуоресцентным красителем кальцеином. Мы обнаружили, что ПЭИ и комплексы ПЭИ с ДНК вызывали выход красителя из липосом, состоящих из лецитина, при pH 4 и ниже, в то время как при нейтральных и слабокислых pH эффекта не было. Было показано, что данный эффект зависит также от состава мембран липосом: выход кальцеина из липосом, содержащих отрицательно заряженный дицетилфосфат происходит при рН 5,5 и ниже, что соответствует значениям рН поздних эндосом. Мы также обнаружили уменьшение мембранолитического эффекта конъюгатов ПЭИ-ПЭГ с увеличением соотношения ПЭГ/ПЭИ после совместной инкубации с липосомами при низких рН.
|
| 3 |
1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. |
Исследование физико-химических характеристик полиплексных наночастиц и механизмов их транспорта и диссоциации в клетках-мишенях |
| Результаты этапа: Определены физико-химические характеристики (гидродинамический диаметр, размер, определяемый методом атомно-силовой микроскопии, и поверхностный потенциал) полиплексов на основе блок-сополимеров полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-(ТАТ-пептид) (ПЭИ-ПЭГ-ТАТ), и возможная связь состава и свойств полиплексов с эффективностью трансфекции ими. Варьируя соотношения ПЭГ/ПЭИ для модификации поликатиона и соотношение ДНК/поликатион в полиплексах, мы выявили варианты, обеспечивающие наиболее эффективную трансфекцию, (до 100%) на ряде клеточных линий.
С помощью метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) с применением технологии резонансного переноса энергии по Фёрстеру (FRET), а также разработанных нами математических моделей мы исследовали кинетику внутриклеточного транспорта и распаковки наночастиц полиплексов. Было показано, что различия в максимальном проценте трансфекции различных клеточных линий обусловлены различиями в процессе внутриклеточного транспорта. Так, мы обнаружили достоверную отрицательную корреляцию между обратной скоростью входа полиплексов в клетку и максимально достигнутой эффективностью трансфекции на разных клеточных линиях. Также была выявлена достоверная отрицательная корреляция между константой скорости распаковки в эндосомах/лизосомах и максимально достигнутой эффективностью трансфекции на разных клеточных линиях.
Наши работы с модульными нанотранспортерами, способными доставлять различные терапевтические агенты в ядра клеток-мишеней, показали эффективность использования меланокортиновых рецепторов для этой цели. Опираясь на полученные данные, мы создали новые лигандированные полиплексы на основе блок-сополимеров ПЭИ-ПЭГ-пептид, с пептидом МК1С, несущим последовательность, являющуюся специфическим лигандом к меланокортиновым рецепторам первого типа, сверхэкспрессированных на поверхности клеток меланом. Полиплексы на основе ПЭИ-ПЭГ-МК1С показали более высокую эффективность трансфекции на клетках мышиной меланомы по сравнению с полиплексами без пептида. Мы экспериментально показали, что это связано с более быстрым рецептор-зависимым входом лигандированных полиплексов в клетки-мишени с повышенной экспрессией меланокортиновых рецепторов. Мы обнаружили с помощью КЛСМ с технологией FRET, что полиплексы с лигандом сразу начинают накапливаться в клетках, в то время как полиплексы без лиганда поступают внутрь клеток с двухчасовой задержкой, что приводит к их распаковке на клеточной поверхности и обуславливает преимущественное накопление в распакованном состоянии, что существенно увеличивает вероятность деградации переносимой ДНК. Кроме того, лигандированные полиплексы быстрее накапливаются в клеточном ядре. Эксперименты по ингибиторному анализу путей эндоцитоза, вовлеченных в поглощение такого рода частиц показали, что наличие лиганда позволяет полиплексам поглощаться клетками более быстрым клатрин-зависимым способом эндоцитоза.
Исследование мембранолитических свойств полиплексов показало, что ПЭИ и комплексы ПЭИ с ДНК вызывали pH-зависимое нарушение целостности липосом, особенно выраженное для липосом, содержащих отрицательно заряженный дицетилфосфат.
Нами были подобраны условия для прижизненной оценки эффективности трансфекции модельных опухолей полиплексами в условиях in vivo с использованием метода однофотонной эмиссионной компьютерной томографии.
Для изучения фармакокинетики и фармакодинамики полиплексов в опухоли был разработан подход с использованием дорзальных накожных камер (“dorsal skinfold chamber”) для прижизненной визуализации ткани опухоли. Кроме того, была разработана схема проведения эксперимента с использованием накожных камер для изучения распространения и накопления полиплексов в ткани модельной опухоли.
|
