![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Фундаментальной задачей, на решение которой направлен проект, является изучение структуры гликопротеинов, молекулы которых ассоциированы с липидами и не связаны ковалентно с основными структурными полимерами КС дрожжей (здесь и далее NCBGLA от англ. non-covalently bound glycoprotein, lipid-associated), обнаруженных нами на клеточной поверхности Saccharomyces cerevisiae и получение ответа на вопрос какова роль этих соединений в регуляции метаболической активности клеточной стенки дрожжей. Основным полученным в процессе выполнения первого этапа работы по проекту результатом является разработка схемы выделения и получение в препаративном количестве выявленного нами ранее NCBGLA-12. Во фракциях, получаемых из клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae с использованием детергентов и бутанола, обнаружены соединения, предварительная характеристика которых позволяет отнести их к группе NCBGLA. Получены антитела к NCBGLA-12 и проверена их специфичность. Оценено содержание NCBGLA-12 в клеточных стенках так называемого дикого типа дрожжей S.cerevisiae “а-” и “альфа”-типов спаривания. Показано, что содержание этого соединения в клеточных стенках клеток “а-” и “альфа”-типов спаривания различается на разных стадиях роста культуры дрожжей. С использованием полученного препарата начата проверка высказанного нами предположения о том, что NCBGLA-12 может являться регулятором метаболической активности клеточной стенки дрожжей, а именно: начато изучение влияния данного соединения на активность и способность к фибриллообразованию глюкантрансферазы Bgl2p, Анализ полученных результатов в совокупности с данными, опубликованными недавно в литературе (Vargas et al., 2014), позволяют сделать предположение о том, что изучаемые в данном проекте NCBGLA принадлежат к транзитным соединениям КС и являются частью содержимого транс-КС везикул, окружённых липидной мембраной, которые могут присутствовать в среде культивирования дрожжей и о наличии которых в клеточной стенке высказывались предположения (Алексеева с соавт., 2014; Vargas et al., 2014).Эксперименты, проведенные на втором этапе, были выполнены в соответствии с планом работ заявленным ранее, однако объем полученных результатов превышал запланированный. Весьма продуктивным направлением исследований явилось обнаружение новых липид-ассоциированных соединений – потенциальных регуляторов метаболической активности клеточной стенки. Наиболее значимым результатом работы явилось обнаружение среди соединений, входящих в состав липид-ассоциированной фракции клеточной стенки белков, ранее считавшихся внутриклеточными и мембранными белками, а недавно выявленными за пределами клетки в составе транспортных везикул, экспортирующих метаболически активные соединения из клетки через клеточную стенку дрожжей Candida albicans во внешнюю среду /Vargas et al., 2014/. В частности были обнаружены такие важные для метаболической активности и клеточной стенки дрожжей белки как белок теплового шока Hsp12, глюкантрансфераза Bgl2p и некоторые другие. Изучено взаимодействие глюкантрансферазы Bgl2p и NCBGLA-12, являющихся компонентами фракции NCBGLA . Продемонстрировано ингибирующее влияние NCBGLA-12 на гидролазную активность Bgl2p. Показано, что NCBGLA-12 представляет собой полипептид, гликозилированный по нескольким сайтам. С помощью флуоресцентной микроскопии, метода LC-MS/MS , а также методов электрофореза в ПААГ и Вестерн-блоттинга показано, что Bgl2p является одним из основных белков липид-экстрагируемой фракции КС, при этом будучи экстрагируемым из КС с помощью метода Фолча (экстракция смесью хлороформ-метанол в соотношении 2:1) в данных условиях он в малой степени переходит в раствор, формируя осадок в виде агрегатов, предположительно фибриллярной структуры. Полученные результаты, подтверждающие высказанную гипотезу о важной роли глюкантансферазы Bgl2p в закреплении комплекса NCBGLA в клеточной стенке, позволяют с высокой долей вероятности предполагать наличие в КС белковых микрокомпартментов, содержащих наборы белков, значимых для регуляции метаболической активности КС, закрепление которых в КС происходит с участием Bgl2p. Показано, что в отсутствии Bgl2p в клеточных стенках (получены из клеток, несущих делецию гена, кодирующего белок Bgl2p) не закрепляются прочно такие белки как маннопротеины CWP1 и CIS3, гликопротеины YGP1 и Tos1, инвертаза Inv2, глюкангидролазы Scw4 и Scw10, глюкантрансферазы Gas1 и Gas3, щелочная фосфатаза PPA. Под прочным закреплением в данном случае мы подразумеваем устойчивость данных белков к обработке 1% додецилсульфотом натрия (ДСН) при 37°С в течение часа. В данных условиях Bgl2p и перечисленные белки остаются в составе КС. Результаты, полученные при выполнении работы позволяют составить принципиально новое представление об организации молекулярной структуры КС и роли липидного компонента в целом и компонентов NCBGLA в регуляции метаболической активности клеточной стенки дрожжей.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Гликопротеины - регуляторы метаболической активности клеточной стенки дрожжей |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Гликопротеины - регуляторы метаболической активности клеточной стенки дрожжей |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Гликопротеины - регуляторы метаболической активности клеточной стенки дрожжей |
Результаты этапа: Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы в области биохимии и физиологии клеточной поверхности микроорганизмов: установления молекулярной структуры, а также выявления основных закономерностей процесса формирования и поддержания целостности многокомпонентного и полифункционального компартмента клетки дрожжей - клеточной стенки. Фундаментальной задачей, на решение которой направлен проект, является изучение структуры гликопротеинов, молекулы которых ассоциированны с липидами и не связаны ковалентно с основными структурными полимерами клеточной стенки дрожжей (здесь и далее NCBGLA от англ. non-covalently bound glycoprotein, lipid-associated), обнаруженных нами на клеточной поверхности Saccharomyces cervisiae, и получение ответа на вопрос какова роль этих соединений в регуляции метаболической активности клеточной стенки дрожжей. На завершающем этапе работы было запланировано проведение экспериментов, направленных на проверку высказанной на втором этапе работы гипотезы о важной роли глюкантрансферазы Bgl2p в закреплении комплекса NCBGLA в клеточной стенке и роли NCBGLA-12 в этом процессе, как потенциального ингибитора активности Bgl2p. Для успешного выполнения данной работы на втором этапе проекта получены новые штаммы дрожжей с делециями и мутациями в гене, кодирующем глюкантрансферазу Bgl2p. Было запланировано, также, определение липидного состава фракции, в которую входят изучаемые соединения NCBGLA-комплекса, а именно: NCBGLА-12 и другие, выявленные при выполнении работ на втором этапе проекта. Планировалось продолжение работы по выявлению новых соединений, входящих в состав комплекса NCBGLA клеточной стенки дрожжей на разных стадиях роста культуры, а также в условиях апоптоза и экспериментов по установлению структуры NCBGLA-12, в первую очередь определение последовательности аминокислот в пептидном компоненте данного соединения, а также проверка рабочей гипотезы о формировании NCBGLA-12 в результате процессинга более протяженного полипептида (расщепления его пептидного компонента и увеличения углеводной части молекулы) как это описано для белка клеточной стенки Scw4 /Teparic and Mrsa, 2013/. Полученые результаты, подтверждают высказанную гипотезу о важной роли глюкантансферазы Bgl2p в закреплении комплекса NCBGLA в клеточной стенке и позволяют с высокой долей вероятности предполагать наличие в КС белковых микрокомпартментов, содержащих наборы белков, значимых для регуляции метаболической активности КС, закрепление которых в КС происходит с участием Bgl2p.Показано, что в отсутствии Bgl2p в клеточных стенках (получены из клеток, несущих делецию гена, кодирующего белок Bgl2p) не закрепляются прочно такие белки как: Protein YGP1, Invertase 2 Inv2, Cell wall protein CWP1, Cell wall mannoprotein CIS3, Probable family 17 glucosidase SCW4, Constitutive acid phosphatase PPA. Данные белки обнаруживаются наряду с Bgl2p во фракции, полученной с использованием 6М гуанидинхлорида. Также в отсутствии Bgl2p в клеточных стенках не могут прочно закрепляться белки Probable family 17 glucosidase SCW4, Cell wall protein CWP1, Probable family 17 glucosidase SCW10, Probable 1,3-beta-glucanosyltransferase GAS3, Constitutive acid phosphatase PPA, Protein TOS1, Protein YGP1, 1,3-beta-glucanosyltransferase GAS1. Данные белки обнаруживаются наряду с Bgl2p во фракции, полученной с использованием в качестве экстрагента раствора 0,1 М Трис, рН 9,2.Идентификацию белков в получаемых фракциях проводили с использованием метода LC-MS/MS (тандемная масс-спектрометрия с предварительной жидкостной хроматографией) в совместной работе с Р.Х.Зиганшиным (ИБХ РАН). Под прочным закреплением в данном случае мы подразумеваем устойчивость данных белков к обработке 1% додецилсульфотом натрия (ДСН) при 37°С в течение часа. В данных условиях Bgl2p и перечисленные белки остаются в составе КС. С помощью флуоресцентной микроскопии, метода LC-MS/MS , а также методов электрофореза в ПААГ и Вестерн-блоттинга показано, что Bgl2p является одним из основных белков липид-экстрагируемой фракции КС, при этом будучи экстрагируемым из КС с помощью метода Фолча (экстракция смесью хлороформ-метанол в соотношении 2:1) в данных условиях он в малой степени переходит в раствор, формируя осадок в виде агрегатов, предположительно фибриллярной структуры. Показано, что во всех фракциях, получаемых с помощью экстракции данного белка из КС с применением в качестве экстрагентов растворов 0,1 М Трис, рН 9,2 и 6 М гуанидинхлорида, в которых Bgl2p неактивен, присутствует соединение, идентифицированное нами на предыдущем этапе работы как глюко-маннановый комплекс с молекулярной массой 12 кДа – NCBGLA. При этом в липид-экстрагируемой фракции данное соединение отсутствует, а Bgl2p проявляет активность при использовании субстрата - β-1,3-связанного гепталаминаринолигосахарида. Глюко-маннановый комплекс с молекулярной массой 12 кДа был выделен нами в практически гомогенном виде из КС дрожжей, несущих делецию гена, кодирующего белок Bgl2p. Показано его ингибирующее воздействие на активность Bgl2p, полученного в результате хроматографического разделения экстрактов из КС методом гель-фильтрации в результате колоночной хроматографии. В результате совместной работы с Алесенко А.В. (ИБХФ РАН) определен состав липидов, экстрагируемых с использование метода Фолча из клеточных стенок до и после обработки их 1% ДСН. Показано, что эти наборы отличаются. Липидный компонент, совыделяющийся с Bgl2p в процессе экстракции по Фолчу, представляет собой набор нейтральных липидов, в то время как ДСН-удаляемая липидная фракция , в которую Bgl2p не экстрагируется, содержит такие соединения как сфингомиелин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Получены результаты, демонстрирующие различную устойчивость клеток дрожжей с делецией гена, кодирующего глюкантрансферазу Bgl2p к соединениям, вызывающим апоптоз, а также различным стрессовым воздействиям, включая высушивание и повышенную температуру. Из клеточных стенок получены препараты белков, анализ которых планируется осуществить в дальнейшем. С использованием штаммов дрожжей с делецией и мутациями в гене, кодирующем глюкантрансферазу Bgl2p, полученных на предыдущем этапе работы показано, что различные мутации приводят к различной экстрагируемости Bgl2p из КС с применением в качестве экстрагентов растворов 0,1 М Трис, рН 9,2 и 6 М гуанидинхлорида, что свидетельствует в пользу наличия в КС нескольких пулов данной глюкантрансферазы, закрепленной различными способами. Количественное соотнесение Bgl2p, экстрагируемого различными способами из КС, полученных из клеток дрожжей, несущих делецию и мутации в гене, кодирующем глюкантрансферазу Bgl2p, позволяет сделать предположение о том, что данный белок одной своей частью закрепляется в КС за глюкановый остов, а другой – ассоциирован с липидами КС и, таким образом, формирует микрокомпартмент, в состав которого входят такие мембранные белки, как идентифицированный нами на предыдущем этапе белок теплового шока с молекулярной массой 12 кДа, а также белки, идентифицированные нами в процессе выполнения данного этапа работы. Изучению данных микрокомпартментов мы планируем посвятить работу в дальнейшем. Результаты, полученные при выполнении работы за отчетный период, позволяют составить принципиально новое представление об организации молекулярной структуры КС и роли липидного компонента в целом и компонентов NCBGLA в регуляции метаболической активности клеточной стенки дрожжей. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".