| 1 |
27 ноября 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Теоретические исследования поставленных задач. Выбор направления исследований. Разработка экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток |
| Результаты этапа: В ходе теоретической работы проведена систематизация сведений об исследуемой проблеме, создан обзор научных информационных источников по тематике исследуемой проблемы. Приведены варианты возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов исследований, проводившихся по аналогичной тематике.
Использование клеточных технологий в терапии повреждений различных органов и тканей является перспективным направлением исследований, поскольку восстановление или замена поврежденного участка, а также нормализация функций происходит за счет оптимального соотношения вводимых клеточных факторов, что ускоряет этот процесс и делает его более эффективным. При лечении обширных повреждений методы клеточной терапии могут существенно сократить время заживления. При терапии ран кожи такой подход позволяет уменьшить вплоть до полного исчезновения образование рубцовой ткани. В результате того, что восстановление происходит путем индукции миграции и пролиферации клеток с соседних участков, восстановленная ткань практически не отличается по своим свойствам от окружающей здоровой ткани. Кроме того, такой подход снижает хирургическую нагрузку на пациента и является менее трудоемким для медицинского персонала. В настоящее время активно развивается направление использования клеток и биосовместимых материалов, выступающих в роли носителей. Такие материалы должны обеспечивать доставку, дифференцировку и миграцию клеток в месте повреждения, а кроме того впоследствии должны замещаться клетками нормальной ткани пациента, быть биологически безопасными и обладать адекватными механическими характеристиками. Для проверки свойств такой системы носитель- клетки, клетки и материал должны использоваться вместе, что дает возможность оценить биосовместимость, их взаимодействие и деградацию побочных продуктов. Простота в использовании конечного продукта будет иметь большое значение в его клиническом применении. Одним из наиболее перспективных направлений тканевой инженерии и регенеративной медицины в настоящее время является разработка, исследование и клиническое использование комплексов, состоящих из искусственного внеклеточного матрикса и клеток, использующих матрикс как субстрат в результате их нанесения и культивирования in vitro или спонтанного заселения in vivo. Матрикс представляет собой изделие, которое отвечает таким требованиям, как биосовместимость, определенные механические, физические свойства и предоставляет субстрат для нормального функционирования клеток. Многими научными группами продолжается поиск адекватных носителей для трансплантируемых клеток, позволяющих упростить технологию трансплантации и усовершенствовать методики лечения заболеваний, обусловленных дефектами клеточных структур и тканей. Особое внимание уделяется разработке подходов к регенерации труднодоступных органов и тканей. Принципиальная возможность создания универсального биорезорбируемого изделия в виде суспензии пористого микроносителя, способного поддерживать жизнеспособность клеток разных типов, позволяет прогнозировать заметный прорыв в области регенеративной медицины. С помощью этой технологии ведутся работы по восстановлению крупных костных фрагментов, утраченных в результате травмы или заболевания, а также по ускорению васкуляризации различных трансплантатов. Эта технология актуальна и для лечения нейродегенеративных заболеваний, поскольку центральная нервная система имеет очень ограниченные возможности для самовосстановления, и введение в нее здоровых клеток может существенно повысить успешность лечения.
Микроносители – это частицы от 100 до 400 мкм в диаметре, которые изготавливаются из различных материалов и могут использоваться для прикрепления клеток и последующего введения в рану. Впервые такой подход был описан в 1967 году van Wezel и соавт. Данные последних исследований в этой области показывают, что введение в кожные раны пористых биорезорбируемыхмых микроносителей, загруженных культивированными кератиноцитами человека, способствовало не только оптимальной реэпителизации раны, но и стимулировало регенерацию всех поврежденных слоев кожи. Таким образом, разработка биорезорбируемых материалов для создания суспензионных препаратов для эффективного лечения глубоких дефектов кожи является чрезвычайно актуальной задачей.
В результате реализации проекта будут разработаны научно-технические основы для создания отечественного микроносителя, предназначенного для целевой доставки клеток, обеспечивающих ускорение репарационных процессов и процессов регенерации. В качестве основы для создания микроносителя будут использован фиброин шелка и другие биорезорбируемые полимеры. Полученные микроносители будут охарактеризованы в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний. С использованием методов световой и электронной микроскопии будет произведен анализ структуры микроносителя. In vivo будет исследован рост клеток разных типов, включая кератиноциты, макрофаги и фибробласты, на макроносителях. Влияние микроносителя на регенеративный потенциал будет изучен в моделях полнослойных ран кожи лабораторных мышей. Процессы заживления и регенерации будут изучены с использованием комбинации биометрических, гистологических и гистохимических методов. По результатам выполненных исследовательских испытаний будет проведена оценка эффективности и безопасности применения микроносителей и даны прогнозы о перспективах их использования для тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Все полученные на 1 этапе данные и документы, содержащие конструктивные и технологические (методические) решения, будут использованы для реализации последующих этапов и выполнения ПНИ в целом.
|
| 2 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Исследование свойств экспериментальных образцов БМНДК in vitro и in vivo |
| Результаты этапа: Для выполнения работ второго этапа проекта в соответствии с Лабораторным регламентом создания экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток было синтезировано 20 г экспериментальных образцов. В соответствии с п. 4.3 Технического задания "Требования к объектам экспериментальных исследований" синтезированные экспериментальные образцы БМНДК имеют следующие параметры: концентрация фиброина шелка в растворе 20 мг/мл, размер микроносителей варьируется от 50 до 400 мкм. Анализ данных показал, что при продолжительной инкубации в нейтральной среде образцы БМНДК были стабильны, после 21 дня инкубации их масса изменялась не более, чем на 15%. Под воздействием гидроксильных радикалов реактива Фентона образцы БМНДК разрушаются к 3-й неделе менее, чем на 50%. Таким образом, можно считать образцы БМНДК устойчивыми к деградации в окисляющей среде в течение 3 недель. Деградация материала предполагает также и биорезорбцию БМНДК в условиях выраженного клеточного ответа или при развитии воспалительных процессов. Исследование особенностей деградации экспериментальных образцов БМНДК в экспериментах in vivo при подкожном введении лабораторным животным показало, что и на 5 и на 21 сутки после имплантации наблюдаются введённые микрочастицы, на которых выявляются многочисленные клетки, что свидетельствует о биорезорбции БМНДК. Показано, что поверхность БМНДК является прекрасным субстратом для адгезии и пролиферации как иммортализованных клеточных культур: фибробластов мыши 3Т3 и человеческих эпидермальных кератиноцитов HaCaT, так и первичных культур клеток: эмбриональных мышиных фибробластов (МЭФ), эпидермальных кератиноцитов мыши и мышиных макрофагов, полученных из костного мозга. При этом количество жизнеспособных клеток в течение 7 дней культивирования составляло не менее 90%.
На основании результатов проекта, полученных за 12 месяцев (2015 г, 2 и 3 этапы), были опубликованы две статьи в российских журналах, индексируемых в базах Web of Science и Scopus:
1. Архипова А.Ю., Котлярова М.С., Новичкова С.Г., Агапова О.И., Куликов Д.А., Куликов А.В., Друцкая М.С., Агапов И.И., Мойсенович М.М. Новые биорезорбируемые микроносители на основе фиброина шелка, в журнале Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Издательство Российской академии медицинских наук (Москва), том 160, № 10, с. 497-501.
2. Мойсенович М.М., Куликов Д.А., Архипова А.Ю., Малюченко Н.В., Котлярова М.С., Гончаренко А.В., Куликов А.В., Машков А.Е., Агапов И.И., Палеев Ф.Н., Свистунов А.А., Кирпичников М.П. Фундаментальные основы использования биорезорбируемых микроносителей на основе фиброина шелка в терапевтической практике на примере регенерации кожи, в журнале Терапевтический архив, Издательство «Медиа Сфера» (Москва), том 87, № 12, с. 66-72.
Также результаты проекта были представлены на трех мероприятиях (российских и с международным участием) по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки.
По условиям Соглашения о предоставлении субсидии в отчетный период необходимо было подать 1 патентную заявку по результатам выполненных прикладных исследований. Анализ выявленных в соответствие с заданием патентного поиска по определению патентоспособности и патентной чистоты предполагаемого изобретения документов показал следующее: на дату проведения дополнительных патентных исследований объект «Биорезорбируемые микроносители для доставки клеток в область заживления и регенерации ран» на территории стран, в отношении которых проводился данный поиск абсолютно идентичных решений найдено не было, поскольку все действующие на сегодняшний день на территории Российской Федерации патенты раскрывают решения, значительно отличающиеся от предлагаемого и, соответственно, не препятствуют его производству.
|
| 3 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Исследование свойств экспериментальных образцов БМНДК в экспериментах in vivo |
| Результаты этапа: Для исследования экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток in vivo была использована модель полнослойной кожной раны мыши. Образцы микроносителей были введены интрадермально экспериментальным животным. Последующее исследование образцов с целью изучения острой токсичности, скорости заживления и полноты регенерации выполнялись с использованием классических гистологических методов, а также посредством анализа макрофотографии ран. Также был выполнен микроскопический и иммунохимический анализы. При проведении исследований был выполнен сравнительный анализ с целью определения влияния витализации экспериментальных образцов микроносителя аллогенными фибробластами, макрофагами и кератиноцитами на скорость заживления и регенерации в моделях полнослойных ран мыши. Исследование влияния последовательного внесения микроносителей с разными отельными типами клеток, участвующими в процессах регенерации, и внесения микроносителей, содержащими композиции клеток, участвующих в процессах регенерации, на скорость и полноту восстановления.
Введение невитализированных экспериментальных образцов БМНДК и витализированных кератиноцитами и макрофагами экспериментальных образцов БМНДК способствовало снижению скорости затягивания раны в первые дни, при этом инъекция экспериментальных образцов БМНДК, витализированных аллогенными фибробластами (МЭФ), не приводила к снижению контракции раны в первые дни. На третий день после нанесения полнослойной раны кожи разницы в площади раны в контрольной и экспериментальных группах не наблюдалось. На 7-ые сутки после нанесения травмы в контрольной и экспериментальных группах животных, получавших инъекции невитализированных и витализированных фибробластами и макрофагами экспериментальных образцов БМНДК, сохранялся струп, при этом площадь раны у животных, которым вводили витализированные микроносители, достоверно отличалась от площади ран у мышей из контрольной группы и животных, получавших инъекции невитализированных микроносителей. В то время как у животных, которым вводили экспериментальные образцы БМНДК, витализированные кератиноцитами, струп отсутствовал и наблюдалось полное заживление раны. Таким образом, было установлено, что витализация экспериментальных образцов БМНДК приводит к ускорению заживления полнослойной раны кожи мыши, при этом витализация микроносителей кератиноцитами ускоряет реэпителизацию раны.
|
