| Результаты этапа: Продолжены исследования сигнальной сети активации RhoA c участием хGalfа13 и фактора обмена гуаниновыми нуклеотидами Larg и их роли в регуляции радиальной интеркаляции и эпиболии у зародышей Xenopus. С применением метода количественной оценки скорости радиальной интеркаляции показано подавление подвижности клеток при искусственной активации сигнальной цепи Galfa13 – Larg – RhoA. Показано, что лизофосфатидиловая к-та ( LPA) поднимает уровень активной RhoA в 2 раза у интактных зародышей и в 4 раза при оверэкспрессии Galfa 13 и Larg. Тестирование рецептора LPAR1 как возможного связующего звена в каскаде дало отрицательный результат.
С применением конфокальной микроскопии показано, что активация RhoA каскадом LPA-G13-Larg значительно увеличивает слой кортикального актина в клетках .Установлено, что оверэкспрессия Galfa13 усиливает локализацию Larg-GFP на мембране.
С помощью RBD-GFP изучена локализация активной формы RhoA в клетках зародышей. Показано,что RhoA-RBD сконцентрована в апикальном кортексе клеток зародыша, и в зоне кольца апикальных контактов на латеральных мембранах. Оверэкспрессия Larg в клетках вызывает рост RhoA-RBD-GFP на мембране и в цитоплазме, указывая на альтернативные ( минуя G13) пути его активации.
Активация RhoA с помощью G13 и(или) Larg увеличивалa образование матрикса из фибронектина втрое ( при совместной инъекции) и меняло его структуру. Тонкая сеть превращалась в систему толстых коротких фибрилл.
Метод атомной силовой микроскопии был использован для исследования с высоким разрешением динамики поверхности живых зародышей шпорцевой лягушки и для изучения механических свойств поверхности в норме и при активации RhoA с участием LPA и Galfa13.
Наблюдали изменения в количестве и распределении микровилли на поверхности клеток, а также изменения границ клеток в составе пласта. Средняя скорость смещения границ составляла 0,5-1,5 мкм/мин. Измеряли упругость кортекса клеток развивающихся зародышей Xenopus. Показан рост значений модуля Юнга по мере развития со ст. бластулы до нейрулы. Увеличение уровня активной RhoA в клетках при инкубации зародышей в лизофосфатидиловой кислоте после инъекции мРНК Galfa13 приводило к росту модуля Юнга примерно в 4 раза , что можно связать с дополнительной сборкой актина в кортексе клето |
