ИСТИНА

Для решения поставленной задачи необходимо было, прежде всего, выделить разные формы – двудоменную и две однодоменные – АПФ и получить моноклональные антитела к разным доменам фермента. Затем необходимо было провести конформационный анализ ангиотензин-превращающего фермента на основе связывания панели моноклональных антител к двум доменам фермента, который позволил бы продемонстрировать уникальность конформации фермента, продуцируемого разными типами клеток, и подготовить теоретическую базу для разрабатываемого метода. Для этой цели в работе использованы экстракты различных тканей, а также жидкие среды человека, содержащие АПФ. Подобный конформационный анализ является абсолютно необходимым условием для корректной детекции АПФ неэндотелиального происхождения в крови больных. Следующим шагом является проверка идеи об изменении уникальной конформации фермента в крови при развитии патологии, а именно, сравнительная характеристика связывания панели моноклональных антител к двум доменам АПФ с ферментом в составе плазмы крови здоровых доноров и больных саркоидозом, болезнью Гоше и хроническим обструктивным бронхитом для выявления различий в топографии фермента в норме и при развитии патологии. Конечным итогом исследований является выбор моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту – маркеров изучаемой патологии.

Получена и очищена двудоменная соматическая форма ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) человека из тканей почек, легких и биологических жидкостей – семенной жидкости и сыворотки крови. Получен индивидуальный N-домен АПФ методом ограниченного протеолиза исходной двудоменной формы фермента. Выделена и очищена однодоменная форма АПФ, соответствующая его С-домену, из сперматозоидов. Полученные препараты охарактеризованы с точки зрения их гомогенности и содержания в них активных молекул. Получены моноклональные антитела к выделенным N- и С-доменам АПФ, соответствующие ранее описанным моноклональным антителам 9В9 и 2H9 к N- и С-доменам фермента, соответственно. Проведен сравнительный анализ связывания моноклональных антител к двум доменам (N- и С-) ангиотензин-превращающего фермента с ферментом из легких, почек, сыворотки крови, семенной жидкости, а также с рекомбинантной формой фермента, продуцируемой СНО-клетками. Выявлены антитела, по-разному связывающиеся с ферментом из разных тканей. Сделан вывод о вероятном различном гликозилировании потенциальных сайтов гликозилирования, входящих в эпитопы связывания этих антител. Выявлена повышенная активность АПФ в плазме крови всех пациентов с болезнью Гоше и в плазме крови около 50% пациентов с саркоидозом. На выборке образцов плазмы крови доноров и пациентов с саркоидозом, болезнью Гоше и хроническим обструктивным бронхитом легких продемонстрировано статистически достоверное изменение связывание ряда моноклональных антител с АПФ из плазмы крови пациентов с саркоидозом и болезнью Гоше по сравнению со связыванием этих антител с ферментом плазмы крови здоровых доноров и пациентов с хрогическим обструктивным бронхитом. Определены антитела - маркеры саркоидоза и болезни Гоше, а именно антитела 3G8, 1G12, 6A12 к N-домену АПФ и антитела 1B3 и 1E10 к С-домену фермента для диагностики саркоидоза и только антитела 3G8 к N-домену АПФ для диагностики болезни Гоше. Сделан вывод о том, что при саркоидозе в кровь поступает АПФ, у которого изменено гликозилирование центров гликозилирования Asn25, Asn82, Asn416, Asn666 и Asn1196 по сравнению с нормой. При развитии болезни Гоше в кровь поступает АПФ, у которого изменено гликозилирование только центров Asn25 и/или Asn82. Полученные данные являются базой для идентификации уникальной конформации ангиотензин-превращающего фермента в норме и при развитии патологии. Проанализированы источники возможных ошибок при применении метода, даны практические рекомендации по его использованию. Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс, включающая лекцию для аспирантов химического факультета МГУ на тему «Эпитопное картирование ангиотензин-превращающего фермента» и задача спецпрактикума для студентов кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ «Метод иммуносорбции». Проведены два научных семинара на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова с участием молодых сотрудников, аспирантов и студентов кафедры: «Методы получения моноклональных антител и анализа их связывания с белками», проведенный 2 октября 2009 года; и «История исследований ангиотензин-превращающего фермента. Современные представления о структуре и функциях фермента. Эпитопное картирование ангиотензин-превращающего фермента: состояние и перспективы для биохимии и медицины», проведенный 15 января 2010 года. Проведено патентное исследование по теме «Конформационный анализ ангиотензин-превращающего фермента: клинические приложения». Молодые сотрудники, аспиранты и студенты, принимавшие участие в проекте, освоили ряд методик, касающихся проведения иммуноферментного анализа, определения активности фермента, модификации белка десиалированием, MALDI-TOF спектрометрии. Результаты, полученные при выполнении проекта, вошли в диссертационную работу Наперовой И.А. на тему «Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека», защищенную на соискание степени кандидата химических наук по специальностям 03.00.23 – биотехнология, 03.00.04 – биохимия.