|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном примененииНИР
Creation of bifunctional therapeutic antibodies for the prevention of viral diseases at mucosal application
- Руководитель НИР: Кирпичников М.П.
- Участники НИР: Алиев Т.К., Аргентова В.В., Долгих Д.А., Ларина М.В., Панина А.А., Петрова Е.В., Топорова В.А.
- Подразделение: Кафедра биоинженерии
- Срок исполнения: 23 сентября 2014 г. - 31 декабря 2016 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 14.607.21.0060
- Номер ЦИТИС: 114112570006
- Тип: Прикладная
- Приоритетное направление научных исследований: Физико-химические основы биологии и биотехнологии
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Ключевые слова:
терапевтические антитела
-
Описание:
Разрабатываемые бифункциональные IgG/IgA-гибридные антитела представляют собой новый класс антивирусных препаратов, обладая рядом значительных преимуществ: - данные препараты обладают возможностью узнавать и уничтожать вирусные частицы различных серотипов вируса гриппа А, что позволяет ожидать высокой эффективности профилактического эффекта вне зависимости от конкретного сезонного штамма вируса. - предлагаемые терапевтические антитела являются полностью человеческими. Данные антитела будут характеризоваться или полным отсутствием или чрезвычайно низкой иммуногенностью, что повысит эффективность терапевтического воздействия. По сравнению с известными препаратами для лечения гриппа предлагаемое лекарственное средство будет характеризоваться минимумом побочных эффектов и не обладать токсичностью, что делает его особенно востребованным для профилактики заражения гриппом у детей, беременных женщин, пациентов с ослабленной иммунной системой. Новизна предлагаемого проекта заключается в том, что в качестве второго белкового компонента бифункционального агента по уничтожению вирусных частиц будут использованы константные домены человеческого иммуноглобулина А. Использование для создания терапевтического средства константного домена IgA класса должно активировать широкий набор антитело-опосредованных эффекторных функций, специфичных в отношении эпителиального покрова слизистых оболочек дыхательных путей, основного пути проникновения вируса в организм человека. Таким образом, в результате объединения вариабельных доменов IgG антитела и константных доменов IgA антитела основным терапевтическим ангентом разрабатываемого средства профилактики инфекции станут бифункциональные IgG/IgA- гибридные антитела. На их основе будут получены средства мукозальной профилактики (аэрозоли, капли, другие средства орошения слизистой). Получение и исследование терапевтичеких рекомбинантных антител IgA- подкласса является актуальным, активно изучаемым направлением современной молекулярной иммунологии и биотехнологии. В мире ведутся исследования по получению рекомбинантных антител IgA-подкласса для терапии инфекционных и онкологических заболеваний. По своей проблематике, научно-технологическому уровню, глубине решения поставленных задач полученные и планируемые результаты проекта полностью соответствуют наиболее передовым мировым исследованиям в данной области. Основными способами достижения заявленных результатов являются - получение различных функционально-активных изоформ бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител, исследование их иммунохимической и биологической активности; - выбор оптимальной композиции средств мукозального применения бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител. Среди факторов риска проекта в плане дальнейшей коммерциализации необходимо отметить относительно более низкий выход, наблюдаемый при экспрессии бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител по сравнению с антителами IgG-подкласса. В связи с этим важной задачей проекта является разработка эффективных способов биосинтеза, повышения выхода целевого продукта и стабильности конечной субстанции. Учитывая сложную структурную организацию изоформ иммуноглобулина А, большое внимание в проекте уделяется разработке не только методов биосинтеза, но и усовершенствованию методов выделения и очистки экспериментальных образцов антител. Значительная роль отводится разработке и валидации методов аналитического контроля качества разрабатываемых препаратов.
-
Планируемые результаты:
В результате выполнения проекта будут: - разработаны генетические конструкции для экспрессии бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител различного биоинженерного формата (мономерные и димерные формы человеческого иммуноглобулина А); - созданы клеточные линии СНО - продуценты бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител различного биоинженерного формата; - проведена оптимизация биосинтеза, разработаны эффективные методы выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител; - получены 4 экспериментальных образца бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител; - проведен биохимический и иммунохимический анализ экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител; - проведены биологические испытания эффективности и безопасности экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител на модельных животных, летально инфицированных различными коллекционными штаммами; - по результатам исследований будет проведен отбор наиболее эффективного биоинженерного формата кандидатного терапевтического антитела. 2. Бифункциональные IgG/IgA – гибридные антитела содержат - белковый домен, обеспечивающий специфичное взаимодействие с поверхностным маркером вирусов. - белковый домен, способствующий элиминации вирусов. Структура и чистота экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител будут подтверждены современными методами генетического, биохимического анализа, в том числе гель-фильтрационной хроматографией и масс-спектрометрией. Степень очистки экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител должна быть не менее 95% по данным гель- электрофоретического и хроматографического анализов. Бифункциональные IgG/IgA – гибридные антитела должны взаимодействовать с поверхностными антигенами не менее 5 актуальных штаммов вируса. Бифункциональные IgG/IgA – гибридные антитела должны характеризоваться параметром EC50 связывания с белками вирусной оболочки различных серотипов вируса не более 500 нг/мл. Эффективная дозировка бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител при мукозальном применении должна быть не более 0,1 мг/кг веса у опытных животных.
- Добавил в систему: Аргентова Виктория Витальевна
Источник финансирования НИР
| ФЦП: Федеральная целевая программа, Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 23 сентября 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении" |
| Результаты этапа: Получены генетические конструкции и оптимальные системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Для этого осуществлены биосинтез и клонирование константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина А IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также J-цепи. Проведена сборка генов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител, адаптированных для эукариотической экспрессии. Разработан лабораторный технологический регламент получения клеточных линий СНО, продуцентов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Получены клеточные линии СНО-продуценты мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также их димеров. Также получена клеточная линия СНО - продуцент широкоспецифичных к гемагглютининам вируса гриппа А полноразмерных антител IgG-подкласса для использования в качестве образца сравнения. Проведена работа по оптимизации процесса биосинтеза с целью увеличения выхода бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Разработана методика выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител с помощью синтезированного сорбента на основе антитело-специфичных моноклональных антител. Проведены биосинтез, выделение и очистка экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1- и IgA2-подклассов, а также полноразмерного антитела IgG-подкласса. Проведено исследование аффинности и кросс-специфичности антител IgG- подкласса и бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител в отношении различных штаммов серотипов H1N1 и H3N2. Показано, что полученные образцы взаимодействуют со всеми исследованными штаммами. При этом наибольшая аффинность наблюдается в отношении I группы гемагглютининов вируса гриппа А | ||
| 2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении" |
| Результаты этапа: Разработан лабораторный технологический регламент получения клеточных линий СНО, продуцентов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Технологическая схема получения состоит из 3-х стадий: трансфекции культуры, селекции линии-продуцента, анализа клеточной линии. Получены генетические конструкции и оптимальные системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Для этого осуществлены биосинтез и клонирование константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина А IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также J-цепи. Проведена сборка генов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител, адаптированных для эукариотической экспрессии. Получены оптимальные системы экспрессии мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител двух изотипов, а также J- цепи. Получены клеточные линии СНО-продуценты мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов. На их основе в результате дополнительной трансфекции экспрессионной плазмидой, содержащей J-цепь, получены продуценты димерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1- изотипов. Проведена работа по оптимизации процесса биосинтеза с целью увеличения выхода бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Разработана методика выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Получены экспериментальные образцы monoIgA1, monoIgA2,dimIgA1, dimIgA2 - мономеры и димеры бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1- и IgA2m1-изотипов. Также получено рекомбинантное антитело FI6-IgG IgG-изотипа против гемагглютининов вируса гриппа А. Проведен иммунохимический анализ кросс-реактивности в отношении различных серотипов вируса гриппа А. Разработан план исследования экспериментальных образцов. В теоретической части ПНИ проведены маркетинговые исследования, подготовлен отчет. Исследованы товарная и стоимостная структура российского рынак препаратов для профилактики и лечения гриппа, проведена оценка доли рынка, которую смогут занять препараты на основе бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител.Осуществлена валидация аналитических методов контроля качества бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. 1) Разработана система экспрессии, позволяющая осуществит получение мономерных и димерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Получены 4 клеточные линии СНО, продуценты мономерной и димерной форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов. Все линии прошли метотрексатную селекцию и первичный клональный анализ. Разработанная методика позволяет осуществлять выделение и двухступенчатую хроматографическую очистку мономерной и димерной форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител с чистотой не менее 95%. Экспериментальные образцы monoIgA1, monoIgA2, dimIgA1, dimIgA2 получены в количестве 22 – 37 мг, а контрольный образец FI6-IgG рекомбинантного антитела IgG-изотипа против гемагглютининов вируса гриппа А в количестве 159 мг. Все полученные образцы имеют степень очистки более 95%. Проведенный иммунохимический анализ экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA –в отношении различных серотипов вируса гриппа А свидетельствует о том, что все образцы распознают 10 реликтовых и актуальных штаммов ВГА в непрямом ИФА, имеют аффинность не хуже 4 нМ и направлены против консервативного эпитопа, расположенного на молекулах гемагглютинина HA0 и НА1 (иммуноблот). Аффинность исследованных образцов по отношению к штаммам серотипа H1N1 выше, чем по отношению к штаммам серотипа H3N2. 2) При разработке оптимальных систем экспрессии использован разработанный коллективом проекта бипромоторный вектор. Данный вектор позволяет осуществлять сбалансированную метотрексатную селекцию линий-продуцентов гетеросубъединичных белков. При селекции клонов-продуцентов использован метод роботизированного флуоресцентного клеточного сортинга, позволивший сократить временные и трудозатраты и способствовать эффективному отбору линий-продуцентов. При разработке методики выделения и очистки на основе моноклональных антител, специфичных к иммуноглобулину А человека синтезированы и исследованы аффинные сорбенты, необходимые для проведения хроматографии бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. 3) Бифункциональные IgG/IgA-гибридные антитела представляют собой новый перспективный объект исследований в антителотерапии. В ряде лабораторий в мире проводятся исследования различных структурных форматов подобных антител для применения в профилактике и терапии инфекционных и онкологических заболеваний. Применяемые в ходе реализации проекта подходы и методология основаны на самом современном уровне знаний и технологий и полностью соответствуют лучшим мировым работам в данной области. | ||
| 3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении" |
| Результаты этапа: Разработан лабораторный технологический регламент получения клеточных линий СНО, продуцентов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Технологическая схема получения состоит из 3-х стадий: трансфекции культуры, селекции линии-продуцента, анализа клеточной линии. Получены генетические конструкции и оптимальные системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Для этого осуществлены биосинтез и клонирование константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина А IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также J-цепи. Проведена сборка генов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител, адаптированных для эукариотической экспрессии. Получены оптимальные системы экспрессии мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител двух изотипов, а также J- цепи. Получены клеточные линии СНО-продуценты мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов. На их основе в результате дополнительной трансфекции экспрессионной плазмидой, содержащей J-цепь, получены продуценты димерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1- изотипов. Проведена работа по оптимизации процесса биосинтеза с целью увеличения выхода бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Разработана методика выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Получены экспериментальные образцы monoIgA1, monoIgA2,dimIgA1, dimIgA2 - мономеры и димеры бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1- и IgA2m1-изотипов. Также получено рекомбинантное антитело FI6-IgG IgG-изотипа против гемагглютининов вируса гриппа А. Проведен иммунохимический анализ кросс-реактивности в отношении различных серотипов вируса гриппа А. Разработан план исследования экспериментальных образцов. В теоретической части ПНИ проведены маркетинговые исследования, подготовлен отчет. Исследованы товарная и стоимостная структура российского рынак препаратов для профилактики и лечения гриппа, проведена оценка доли рынка, которую смогут занять препараты на основе бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Осуществлена валидация аналитических методов контроля качества бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Разработана Программы и методики испытаний бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител, проведены испытания. Исследованы биологические свойства бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител в экспериментах in vitro и - способы мукозального применения бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Проведено исследование эффективности бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител на модельных животных. 1) Разработана система экспрессии, позволяющая осуществит получение мономерных и димерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. Получены 4 клеточные линии СНО, продуценты мономерной и димерной форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов. Все линии прошли метотрексатную селекцию и первичный клональный анализ. Разработанная методика позволяет осуществлять выделение и двухступенчатую хроматографическую очистку мономерной и димерной форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител с чистотой не менее 95%. Экспериментальные образцы monoIgA1, monoIgA2, dimIgA1, dimIgA2 получены в количестве 22 – 37 мг, а контрольный образец FI6-IgG рекомбинантного антитела IgG-изотипа против гемагглютининов вируса гриппа А в количестве 159 мг. Все полученные образцы имеют степень очистки более 95%. Проведенный иммунохимический анализ экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA –в отношении различных серотипов вируса гриппа А свидетельствует о том, что все образцы распознают 10 реликтовых и актуальных штаммов ВГА в непрямом ИФА, имеют аффинность не хуже 4 нМ и направлены против консервативного эпитопа, расположенного на молекулах гемагглютинина HA0 и НА1 (иммуноблот). Аффинность исследованных образцов по отношению к штаммам серотипа H1N1 выше, чем по отношению к штаммам серотипа H3N2. Проведено исследование бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител in vitro и на мышиных моделях гриппозной пневмонии in vivo. Для подтипов A/California/07/09 (H1N1)pdm09, A/mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) значения IC50 антител IgА1-изотипа составили 0.5; 0,1 и 0,5 мкг/мл, индексы селективности – 200, 1000 и 200 соответственно, снижение титра вируса – 4 порядка, что характерно для препаратов с высокой противовирусной активностью. Интраназальное введение антител IgA-изотипа наиболее эффективно в сравнении с IgG- изотипом и внутрибрюшинной формой введения у мышей, зараженных A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2). При этом вплоть до 7-8 дня после заражения выживаемость животных, получивших интраназальную профилактику, сопоставима с выживаемостью животных, которым вводили контрольный препарат Тамифлю. 2) При разработке оптимальных систем экспрессии использован разработанный коллективом проекта бипромоторный вектор. Данный вектор позволяет осуществлять сбалансированную метотрексатную селекцию линий-продуцентов гетеросубъединичных белков. При селекции клонов-продуцентов использован метод роботизированного флуоресцентного клеточного сортинга, позволивший сократить временные и трудозатраты и способствовать эффективному отбору линий-продуцентов. При разработке методики выделения и очистки на основе моноклональных антител, специфичных к иммуноглобулину А человека синтезированы и исследованы аффинные сорбенты, необходимые для проведения хроматографии бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. 3) Бифункциональные IgG/IgA-гибридные антитела представляют собой новый перспективный объект исследований в антителотерапии. В ряде лабораторий в мире проводятся исследования различных структурных форматов подобных антител для применения в профилактике и терапии инфекционных и онкологических заболеваний. Применяемые в ходе реализации проекта подходы и методология основаны на самом современном уровне знаний и технологий и полностью соответствуют лучшим мировым работам в данной области. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".