Структура и свойства четырех мутантов малого белка теплового шока Hsp27, экспрессируемых при различных формах нейропатий человекаНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 6 ноября 2012 г.-31 декабря 2012 г. Выделение и очистка четырех мутантных форм малого белка теплового шока человека Hsp27, коррелирующих с развитием дистальной моторной нейропатии
Результаты этапа: Получены молекулярно-биологические конструкции, кодирующие четыре мутантные формы (G84R, L99M, R140G, K141Q) малого белка теплового шока человека Hsp27 (HspB1), экспрессируемые при различных формах невропатий. Подобраны оптимальные условия экспрессии указанных белков в клетках E.coli. Разработан метод выделения указанных белков и Hsp27 дикого типа из клеток бактерий. При помощи методов фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации получены гомогенные препараты четырех указанных мутантов и белка дикого типа с выходом 15-30 мг белка из одного литра культуры бактерий. Проведено исследование структуры белка дикого типа и его R140G и K141Q мутантов. Установлено, что в широком интервале концентраций белок дикого типа образует крупные олигомеры с молекулярной массой 560 кДа. Аналогичные олигомерные комплексы характерны и для K141Q мутанта, однако олигомеры этого белка склонны к диссоциации при низких концентрациях белка. Мутант R140G образует как очень крупные олигомеры, так и малые олигомеры с молекулярной массой 70 кДа. Hsp27 дикого типа способен образовывать два типа гетероолигомеров с малым белком теплового шока Hsp20 (HspB6), при этом образование гетероолигомеров возможно только при повышенной температуре. В отличие от белка дикого типа, мутант R140G не способен образовывать крупных гетероолигомеров с Hsp20 (HspB6). Мутант K141Q образует два типа гетероолигомеров с Hsp20, при этом малые гетероолигомеры с молекулярной массой 80 кДа могут образовываться как при низкой, так и при высокой температуре. Измеренная в условиях in vitro шапероноподобная активность убывает в ряду белок дикого типа > K141Q > R140G. Высказано предположение, что возникновение невропатии может быть отчасти связано с пониженной шапероноподобной активностью и нарушением нормальной четвертичной структуры в случае R140G мутанта или с повышенной подвижностью и скоростью обмена субъединиц в случае K141Q мутанта Hsp27.
2 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Исследование физико-химических свойств четырех мутантных форм малого белка теплового шока человека Hsp27, коррелирующих с развитием дистальной моторной нейропатии
Результаты этапа: Проведено исследование физико-химических свойств четырех мутантов HspB1, экспрессия которых коррелирует с развитием дистальной моторной нейропатии или болезни Шарко-Мари-Ту. Установлено, что точечная мутация K141Q слабо влияет на физико-химические свойства HspB1, однако сопровождается некоторым уменьшением шаперонной активности. Мутаций R140G приводит к изменению гидрофобных свойств белка и понижает его устойчивость к протеолизу. Указанная мутация приводит к изменению олигомерного состояния HspB1. В зависимости от концентрации мутант R140G либо образует очень крупные олигомеры (агрегаты), либо диссоциирует до малых олигомеров с кажущейся молекулярной массой около 70 кДа. Мутант R140G обладает очень низкой шапероноподобной активностью. Обнаруженные изменения свойств могут быть связаны с тем, что остаток R140 образует солевой мостик с остатком D129 соседнего мономера и таким образом играет важную роль в стабилизации межмономерных контактов. Замена крупного положительно заряженного остатка аргинина на глицин приводит к существенной дестабилизации структуры HspB1. Мутации G84R и L99M также сопровождаются дестабилизацией структуры крупных олигомеров HspB1, которые при низкой концентрации белка диссоциируют до малых олигомеров с кажущейся молекулярной массой около 100 кДа. Фосфорилирование под действием МАРКАР2 киназы до уровня 0,6 моля фосфата на моль белка приводит к практически полной диссоциации крупных олигомеров G84R и L99M и лишь к частичной диссоциации крупных олигомеров белка дикого типа. Мутации G84R и L99M приводят к уменьшению шаперонной активности HspB1. Указанные изменения свойств могут быть следствием изменения подвижности N-концевого домена HspB1 и/или изменением структуры гидрофобного ядра, стабилизирующего структуру мономера. Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе патологических процессов, возникающих при некоторых нейродегенеративных заболеваниях.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".