ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Чтобы расширить наше понимание об основах жизни крайне важно исследовать динамику биологических процессов на уровне взаимодействия отдельных биомолекул, которая определят кинетику и механизм биохимических реакций. На данный момент существует ряд экспериментальных методов изучения макромолекулярной динамики в цитоплазме, однако, получаемые таким образом результаты содержат усредненную информацию о внутриклеточном движении. Невозможность более тщательного наблюдения биологических процессов обусловлена разрешающей способностью используемого оптического оборудования, связанной с дифракционной природой света. Выполнение данного проекта направлено на создание инновационной методики исследования динамики биомолекул в живых системах, основанной на ядерной гамма-резонансной спектроскопии зондированных в цитоплазму наночастиц оксида железа. Существенно, что временное разрешение определяется временем жизни возбужденного состояния ядра 57Fe и на несколько порядков превосходит разрешение существующих оптических методов. Ожидается, что полученные в ходе реализации проекта результаты, зафиксированные в наносекундном временном диапазоне, будут содержать информацию об индивидуальных макромолекулярных взаимодействиях и окажутся востребованными в сфере биоинформатики и внесут вклад в современное представление о принципах функционирования жизни.
To expand our understanding of the fundamentals of life, it is extremely important to investigate the dynamics of biological processes at the level of interaction of individual biomolecules that will determine the kinetics and mechanism of biochemical reactions. At the moment, there are a number of experimental methods for studying macromolecular dynamics in the cytoplasm, however, the results obtained in this way contain averaged information on intracellular motion. The impossibility of more careful observation of biological processes is due to the resolving power of the optical equipment used, connected with the diffraction nature of light. The implementation of this project is aimed at creating an innovative method for studying the dynamics of biomolecules in living systems based on nuclear gamma resonance spectroscopy of iron oxide nanoparticles sounded into the cytoplasm. It is essential that the temporal resolution is determined by the lifetime of the excited state of the 57Fe nucleus and exceeds by several orders of magnitude the resolution of the existing optical methods. It is expected that the results, obtained in the course of project implementation, fixed in the nanosecond time range, will contain information on individual macromolecular interactions and will be in demand in the field of bioinformatics and will contribute to the modern understanding of the principles of functioning of life.
1) Будут разработаны и оптимизированы оригинальные методики безотходного синтеза магнитных нанозондов на основе магнетита, в том числе нанозондов с изотопно-обогащенным железом, с размерами магнитного ядра от 10 до 100 нм. 2) Будут получены коллоиды магнитных нанозондов, стабильные в физиологической среде и в условиях естественного макромолекулярного краудинга. 3) Магнитные нанозонды и коллоиды на их основе будут охарактеризованы комплексом современных физико-химических методов анализа. 4) Полученные коллоиды будут проанализированы на предмет эффективности их взаимодействия с монохроматическим гамма-излучением в условиях модельных сред и в живых организмах. 5) Будет проведена оценка токсичности коллоидов магнитных нанозондов на клеточных культурах.
В настоящее время на базе химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова имеется всё необходимое исследовательское оборудование для получения опытных образцов магнитных нанозондов и их последующего анализа современным комплексом физико-химических методов. Данные методики разработаны с применением новейшего и уникального оборудования и соответствуют высокому международному уровню. Научный коллектив под руководством Мажуги Александра Георгиевича имеет высококлассных специалистов по синтезу магнитных наночастиц. Значительный опыт по синтезу и характеристике наночастиц различной морфологии и размеров подтверждается представительным списком публикаций в высокорейтинговых журналах. К настоящему времени научным коллективом был разработан и оптимизирован ряд оригинальных методик по синтезу магнитных частиц с узким распределением по размерам. Помимо этого, к настоящему времени осуществлена возможность селективной функционализации поверхности наночастиц магнетита путем ковалентного и нековалентного связывания с различными молекулами стабилизирующих веществ и терапевтических агентов. В частности, было проведено покрытие полученных наночастиц биосовместимым сополимером на основе полиэтиленгликоля с полипропиленгликолем для получения стабильных водных коллоидов и проведения in vitro исследований.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 26 октября 2017 г.-26 октября 2018 г. | Синтез биосовместимых магнитных нанозондов для реализации нового метода исследования живых систем, основанного на ядерной гамма-резонансной спектроскопии |
Результаты этапа: Разработаны и оптимизированы оригинальные методики безотходного синтеза магнитных нанозондов на основе магнетита, в том числе нанозондов с изотопно-обогащенным железом, с размерами магнитного ядра от 10 до 100 нм. 2) Получены коллоиды магнитных нанозондов, стабильные в физиологической среде и в условиях естественного макромолекулярного краудинга. 3) Магнитные нанозонды и коллоиды на их основе охарактеризованы комплексом современных физико-химических методов анализа. 4) Полученные коллоиды проанализированы на предмет эффективности их взаимодействия с монохроматическим гамма-излучением в условиях модельных сред и в живых организмах. 5) Проведена оценка токсичности коллоидов магнитных нанозондов на клеточных культурах. | ||
2 | 6 декабря 2018 г.-3 декабря 2019 г. | Синтез биосовместимых магнитных нанозондов для реализации нового метода исследования живых систем, основанного на ядерной гамма-резонансной спектроскопии |
Результаты этапа: В рамках проведения НИР по разработке и апробации методик синтеза биосовместимых магнитных нанозондов, стабильных в естественных условиях цитоплазмы клетки, был проведен обзор современной методической и научно-технической литературы, посвященный проблемам изучения внутриклеточной динамики в условиях макромолекулярного краудинга, по результатам которого было установлено, что при больших объемных долях макромолекул, присутствующих в цитоплазме клетки (≈ 25%), скорость диффузионного транспорта и, как следствие, значение коэффициента диффузии, который в свою очередь зависит от вязкости жидкой фазы цитоплазмы и гидродинамических параметров среды, уменьшается до 20% от значения предела разбавления. В связи с тем, что цитоплазма клеток заполнена ансамблями различных макромолекул, объемная доля которых может варьироваться и достигать 25%, а значение коэффициента вязкости во внутриклеточных компартментах может достигать высоких значений порядка 50 сП (140 сП в случае локальной микровязкости), нами были впервые разработаны и получены различные модельные среды на основе водных растворов глицерина с различной массовой концентрацией и белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА) с различным объемным содержанием, выступающего в роли краудинг-агента. При этом объемная доля φ белка в полученных модельных средах варьировалась от 5 до 25%, в то время как необходимые значения вязкости сред достигались путем изменения их температуры. В результате, нами был получен набор экспериментальных данных, который позволил спрогнозировать зависимость вязкости модельных сред как от массовой доли глицерина и объемной доли белка, так и от температуры изучаемых модельных сред. Для непосредственного наблюдения за эффектом макромолекулярного краудинга и изучения его количественных характеристик с использованием метода ядерной гамма-резонансной спектроскопии, нами впервые были получены высококонцентрированные коллоиды магнитных нанозондов (>1 мг/мл) с изотопно-обогащенным железом 57Fe на основе наночастиц феррита кобальта Co57Fe2O4, которые затем были диспергированы в модельных средах с различной объемной долей крадудинг-агента для последующей регистрации мессбауэровских спектров. В ходе проведенных экспериментов было установлено, что полученные магнитные нанозонды сохраняли высокую агрегативную устойчивость (более 30 дней) во всех модельных средах, даже при объемной доле белка 25%, что являлось одним из ключевых факторов для интерпретации полученных результатов в связи с тем, что значение коэффициента диффузии напрямую зависит от гидродинамических параметров среды. Более того, в ходе экспериментов нами был показан интересный эффект синергии значений вязкости сред в присутствии молекул краудинг-агента (БСА), вто время как сами магнитные нанозонды не оказывали никакого влияния на вязкость изучаемых сред. После проведения соответствующей пробоподготовки, были зарегистрированы мессбауэровские спектры магнитных нанозондов в средах, имеющих одинаковую вязкость (50 сП), но отличающихся содержанием в них краудинг-агента, на основании чего были отобраны наиболее перспективные образцы для проведения дальнейших исследований. Полученные результаты за время выполнения НИР были опубликованы в высокорейтинговых рецензируемых зарубежных изданиях. | ||
3 | 4 марта 2020 г.-28 февраля 2021 г. | Синтез биосовместимых магнитных нанозондов для реализации нового метода исследования живых систем, основанного на ядерной гамма-резонансной спектроскопии |
Результаты этапа: В рамках проведения НИР по разработке и апробации методик синтеза биосовместимых магнитных нанозондов для реализации нового метода исследования живых систем, основанного на ядерной гамма-резонансной спектроскопии, были разработаны не имеющие аналогов в научной литературе методики синтеза монодисперсных наночастиц сложных оксидов железа (в том числе, обогащенные изотопом железа 57Fe) c контролируемыми формами, размерами и фазовым составом. С использованием современного комплекса физико-химических методов анализа были установлены механизмы формирования наночастиц, а также проведена комплексная оценка структуры и свойств полученных материалов. С целью придания наночастицам агрегативной устойчивости в физиологических средах, в том числе, содержащих значительное количества макромолекул (крадинг-агента), были разработаны методики функционализации наночастиц различными органическими лигандами, как путем реализации механизма нековалентной адсорбции, так и путем их конъюгации с образованием прочных ковалентных связей. Для оценки эффективности взаимодействия синтезированных наночастиц с монохроматических гамма-излучением в условиях, приближенных к цитоплазме живой клетки, т.е. в условиях краудинга, были получены модельные среды различной вязкости. При этом в качестве краудинг-агента выступал высокомолекулярный (66,4 кДа) белок – бычий сывороточный альбумин (БСА), объемная доля которого в растворах варьировалась в диапазоне φБСА = 0 – 25%. Проведенные исследования показали, что с увеличением φБСА значения трансляционного коэффициента диффузии наночастиц убывают по экспоненциальному закону, согласующемуся с ранее описанной диффузионной моделью Филлиса. При этом, уже при φБСА = 20% нормализованный коэффициент трансляционной диффузии наночастиц снижается на 86% по сравнению с раствором, не содержащем белка. В ходе экспериментов было также показано, что традиционно используемый для описания гидродинамических характеристик коллоидов наночастиц метод динамического светорассеяния (ДСР) приводит к занижению истинных значений коэффициентов диффузии и, как следствие, не может быть применен в условиях макромолекулярного краудинга. На заключительном этапе работ была проведена оценка цитотоксичности и степени эндоцитоза полученных наночастиц на клеточных культурах различного типа. Было показано, что сами по себе наночастицы не оказывают токсического эффекта вплоть до концентраций 100 мкг наночастиц/мл. Кроме того, для повышения эффективности адресной доставки и степени накопления наночастиц в клетках, дополнительно проводили функционализацию наночастиц векторными лигандами, специфическими в отношении определённых типов клеточных рецепторов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".