ИСТИНА

Окислительный стресс (ОКС) играет важную роль в патогенезе таких социально-значимых заболеваний, как атеросклероз, сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, канцерогенез, ревматоидные, нейродегенеративные (болезни Паркинсона, Альцгеймера). Достоверная диагностика и прогностика ОКС, а значит и оценка риска развития социально-значимых заболеваний основаны на определении комплекса специальных маркеров – редокс-активных молекул белковой и небелковой природы в биологических жидкостях. Информация о содержании таких маркеров позволяет не только оценить степень ОКС и эффективность защитных сил организма в противодействии ему, но и косвенно выявлять сопутствующие другие заболевания. Неустойчивость таких маркеров в живых системах в условиях развития ОКС обусловливает потребность в чувствительных, но при этом простых, точных и экспрессных (длительность анализа не должна превышать 15-30 мин) методов их определения в биологических жидкостях. Существующие инструментальные методы (например, ВЭЖХ-МС) и сенсорные (ферментативные и иммунохимические) системы для определения маркеров и инициаторов ОКС не удовлетворяют в полной мере выдвигаемым требованиям к чувствительности, селективности, простоте и экспрессности. В связи с этим целью заявляемого фундаментального исследования является создание новых оптических мультисенсорных устройств и твердофазных спектрофотометрических и флуоресцентных индикаторных систем для экспрессного, чувствительного и селективного определения комплекса маркеров и инициаторов окислительного стресса (липидных гидропероксидов, малонового диальдегида, каталазы, цитохрома с, глутатиона и миелопероксидазы, супероксиддисмутазы, биофлавоноидов, витаминов А, Е, С, билирубина, глутатиона, адреналина, полиаминов, сывороточного альбумина, артемизинина и др.) в целях прогностики и диагностики социально значимых заболеваний. Для достижения указанной актуальной цели необходимо будет создать на основе полимерных структур (хитозана и целлюлозы) новые универсальные мультисенсорные покрытия (пленки) на поверхности твердых оптических носителей (стеклах) и в ячейках полистирольного планшета и предложить подходы к их интеграции с серийно-выпускаемыми приборами (спектрофотометрами и флуориметрами). Все разработанные методики определения маркеров окислительного стресса будут апробированы в анализе биологических жидкостей – крови и моче. Полученные результаты исследования будут отличаться научной новизной и практической значимостью и соответствовать мировому уровню.

The aim of the project includes the development of novel optical multisensory devices and solid phase spectrophotometric and fluorometric indicator systems for the rapid, sensitive, and selective determination of complex of oxidative stress markers in biological samples with the purpose of prognostics and diagnostics of socially important diseases.

1. Создание новых универсальных пленочных мультисенсорных покрытий (пленок) на поверхности твердых оптических носителей (стеклах) и ячейках полистирольного планшета на основе полимерных структур (природных полимеров хитозана и целлюлозы) для высокочувствительного, селективного и экспрессного определения комплекса маркеров окислительного стресса в биологических объектах (плазме крови и моче) методами спектрофотометрии и флуоресценции. 2. Адаптация формы создаваемых сенсорных элементов для современных флуориметров с держателем для твердых образцов, спектрофотометров и флуориметров с классическим кюветными отделениями и планшетными приставками. 3. Разработка новых твердофазных спектрофотометрических и флуоресцентных индикаторных систем в целях повышения чувствительности, селективности и экспрессности известных методик определения маркеров ОКС и АОС (каталазы, цитохромома С, глутатион- и миелопероксидазы, супероксиддисмутазы, гидроперекисей липидов, малонового альдегида, биофлавоноидов, витаминов А, Е, С, каротиноидов, билирубина, глутатиона, адреналина, полиаминов, сывороточного альбумина и т.д) в плазме крови и моче. При создании новых индикаторных систем, предлагаемых для работы, для спектрофотометрической и флуоресцентной регистрации аналитического сигнала особое внимание будет уделяться их спектральным характеристикам, чтобы предотвратить мешающее влияние фона за счет неучтенных компонентов биологических объектов. 4. Разработка подходов к импрегнированию компонентов индикаторных систем (биокатализаторов, вспомогательных реагентов) в состав сенсорных пленочных структур на основе полимерных материалов. Контроль за морфологией поверхности мультисенсорных пленочных покрытий будет осуществляться методами оптической и сканирующей электронной микроскопии, чувствительность сенсорных систем и воспроизводимость от сенсора к сенсору будут контролироваться методами твердофазной флуоресценции и спектрофотометрии. 5. Оптимизация детектирующих спектрофотометрических и флуоресцентных индикаторных систем для единовременного мультисенсорного определения маркеров ОКС и АОС (каталазы, цитохромома С, глутатион- и миелопероксидазы, супероксиддисмутазы, гидроперекисей липидов, малонового альдегида, биофлавоноидов, витаминов А, Е, С, каротиноидов, билирубина, глутатиона, адреналина, полиаминов, сывороточного альбумина и т.д) в плазме крови и моче в анализе сложных объектов без предварительного отделения компонентов матрицы исследуемого биообъекта. 6. На основе нового комбинированного подхода, а именно создания мультисенсорных биораспознающих оптических сенсорных устройств, адаптированных под серийно выпускаемые приборы (спектрофотометры и флуориметры), и твердофазных индикаторных систем, разработка методик определения экспрессного, чувствительного и селективного единовременного мультисенсорного определения комплекса маркеров ОКС и АОС в целях прогностики и диагностики социально значимых заболеваний. Апробация разработанных методик в анализе реальных объектов – плазме крови и моче.

В рамках предыдущего проекта РФФИ коллективом авторов разработаны методики получения целлюлозных пленок методом растворения-осаждения микрокристаллической целлюлозы в гидрофильной ИЖ, хлориде или ацетате 1-бутил-3-метилимидазолия, изучены механические и оптические свойства этих целлюлозных пленок. Показано, что оптические и каталитические свойства иммобилизованных в такие пленки реагентов (синтетических красителей и ферментов, например растительных пероксидаз) главным образом зависят от природы аниона ИЖ, используемой для растворения и регенерации целлюлозы. Такого рода систематические и сравнительные исследования были проведены авторами впервые. Разработкой новых спектрофотометрических и флуоресцентных систем для определения антималярийных эндопероксидных соединений коллектив авторов предлагаемого проекта занимается последние три года. За это время проведен скрининг более 10 индикаторных оптических систем, в результате которого выявлена и детально изучена наиболее перспективная флуоресцентная система пиронин Б{Мn(II)-додецилсульфат натрия}артемизинин. С использованием этой системы в растворе разработана чувствительная и селективная методика определения артемизинина в интервале его концентраций 0,2 – 8 мкМ. Оригинальность предложенной системы состоит в использовании вместо биокатализатора (гемсодержащих белка или фермента класса оксидоредуктаз) недорогого синтетического катализатора  комплекса {Mn(II)додецилсульфат натрия} практически без потери в чувствительности определения. Таким образом, предложенный сенсорный материал в виде оптически прозрачной и прочной целлюлозной пленки в комбинации с изученной флуоресцентной системой являются надежным заделом для разработки оптического сенсора для определения артемизинина.

Целью заявляемого фундаментального исследования являлось создание новых оптических мультисенсорных устройств и твердофазных спектрофотометрических и флуоресцентных индикаторных систем для экспрессного, чувствительного и селективного определения комплекса маркеров окислительного стресса и антиоксидантов в биологических объектах. На основе новых оригинальных приемов разработаны флуоресцентные индикаторные системы для экспресс-определения антиоксидантов - флавоноидов, как в растворе, так и в твердофазном варианте. Один из приемов заключается в получении интенсивно флуоресцирующих производных флавоноидов в результате взаимодействия продуктов их пероксидазного окисления с ароматическим амином - 1,2-дифенилэтилендиамином (ДЭД). Предложенный прием позволяет определять флавоноиды на микромолярном уровне концентраций и одновременно за 15-30 мин анализировать до 20 образцов проб в ячейках полистирольного планшета с иммобилизованной в прозрачной пленке хитозана пероксидазой. При использовании вместо пероксидазы ее миметика - комплекса железа(III) с тетрамидомакроциклическим лигандом (ТАМЛ) образуется такой же продукт дериватизации флавоноидов, что и в присутствии пероксидазы, однако чувствительность методик определения флавоноидов ниже. Предложенные индикаторные системы могут быть использованы для экспрессного, высокочувствительного, селективного и воспроизводимого определения кверцетина, эпикатехина, кофейной кислоты и таксифолина в диапазонах концентраций 0.1-5, 1-10, 0.1-10, 0.5-5 мкM соответственно. Те же системы можно применять для флуориметрического детектирования флавоноидов после их разделения методом ВЭЖХ в диапазонах концентраций 0.16 - 2.5, 0.17 - 2.6, 0.06 – 4.2 мкM соответственно, а также хроматографически анализировать объекты с неизвестным заранее сочетанием флавоноидов. Разработанные методики успешно применены для анализа различных фармацевтических препаратов, содержащих флавоноиды, и для анализа растительного сырья. Реакции дериватизации продуктов ферментативного окисления флавоноидов - кофейной кислоты и эпикатехина с ДЭД в присутствии пероксидазы либо ее миметика – комплекса Fe(III) с ТАМЛ использованы для определения 5-100 мкМ окислителей продукта дериватизации - неорганического и органических пероксидов в целях экспресс-диагностики окислительного стресса по их содержанию в крови. Другой перспективной системой для определения пероксидов водорода, мочевины и кумола, 2-бутанонпероксида, трет-бутилгидропероксида (ПО 2 - 250 мкМ) оказалась реакция образования флуоресцирующего комплекса Eu(III)-тетрациклин, интенсивность флуоресценции которого возрастает при присоединении к нему пероксида. Эта реакция изучена не только в водной среде, но и в присутствии органических растворителей - ацетона, этанола, ацетонитрила, ДМСО, а также ПАВ - ТВИН 80, ТРИТОН Х-100, ДДС и ЦТАБ. Выяснено, что гидропероксиды целесообразно определять только в среде ацетона. Предложенные флуоресцентные индикаторные системы для определения гидропероксидов апробированы в анализе биологических объектов (плазме крови мышей и в клетках аденокарциномы толстой кишки человека). Для одновременного мультиплексного высокоселективного определения катехоламинов (допамина, адреналина, норадреналина) и их метаболитов (гомованилиновой и ванилилминдальной кислот) впервые использовано сочетание дериватизации продуктов их ферментативного окисления одновременно с двумя различными ароматическими аминами - бензиламином (БА) и 1,2-дифенилэтилендиамином (ДЭД) с обработкой спектров (для повышения их разрешения) образующихся интенсивно флуоресцирующих производных методами производной флуориметрии первого и второго порядков. Флуоресценцию измеряли в 96-луночном планшете, в ячейках которого помещен биочувствительный полимерный слой хитозана с иммобилизованной пероксидазой. Мультиплексное определение катехоламинов и их метаболитов одновременно из одной пробы достигается за счет направленного регулирования длин волн возбуждения и испускания (в интервалах 300 - 356 и 425 – 480 нм, соответственно). Разработанные сенсорные системы и методики на их основе, адаптированные под серийное оборудование, обеспечивают высокочувствительное (в диапазоне концентраций 3–200 нM), селективное и воспроизводимое (Sr ≤ 0.01, n = 5) определение катехоламинов и их метаболитов. Они успешно применены для экспрессного анализа (20 образцов за 15–30 мин) мочи человека и плазмы крови мышей. Методики позволяют селективно определять одни катехоламины на фоне других, что позволяет применять их для экспресс-диагностики таких катехоламин-продуцирующих заболеваний, как карциноид, феохромоцитома и нейробластома.