ИСТИНА

Тиофлавин Т является одним из наиболее популярных зондов в биохимии и биомедицине для детектирования нитевидных агрегатов белков – фибриллярных структур, которые являются крайне актуальным объектом исследований в связи с их вовлеченностью в патогенез ряда тяжелых заболеваний. Принцип действия тиофлавина Т заключается в том, что квантовый выход его флуоресценции возрастает на порядки при специфическом связывании зонда фибриллами, при этом в основе столь высокой чувствительности лежит механизм «молекулярного ротора» - увеличение жесткости микроокружения приводит к выделенной ориентации дипольных моментов в связи с фиксацией геометрии тиофлавина Т в возбужденном состоянии. Тем не менее, несмотря на изученность фотофизики тиофлавина Т, относительно недавно в литературе было показано, что кинетика изменения времени жизни возбужденного состояния и интенсивность флуоресценции тиофлавина при образовании фибрилл существенно различается, что не до конца согласуется с общепринятой картиной. Так, время жизни возбужденного состояния тиофлавина растет на начальных этапах образования фибрилл и выходит на плато, когда интенсивность флуоресценции только начинает расти заметным образом. Было высказано предположение о том, что время жизни и интенсивность флуоресценции тиофлавина чувствительны к разным белковым структурам, соответственно, в основе их изменения лежат разные физические процессы, однако никаких объяснений данного эффекта в литературе нет. В качестве гипотезы, которая будет проверена в результате выполнения данного проекта, рассматривается различное влияние параметров микроокружения на скорости радиационного и нерадиационного затухания возбужденного состояния тиофлавина Т, а также их связь с особенностями сайтов связывания тиофлавина в фибриллярных структурах различной морфологии. В проекте будет осуществлено решение данной задачи, на основе чего будут разработаны новые подходы к диагностике фибриллярных структур с использованием флуоресцентных зондов, в частности, к решению актуальной биомедицинской проблемы детектирования фибрилл на ранних стадиях их формирования.

Thioflavin T is one of the most popular probes in biochemistry and biomedicine for the detection of filamentous aggregates of proteins - fibrillar structures, which are extremely relevant subject of research in connection with their involvement in the pathogenesis of a number of serious diseases. The principle of the action of thioflavin T is that the quantum yield of its fluorescence increases by orders of magnitude with specific binding of the probe with fibrils, while the mechanism of the "molecular rotor" lies at the basis of such a high sensitivity - an increase in the rigidity of the microenvironment leads to an isolated orientation of the dipole moments in connection with fixation of the geometry thiophlavin T in the excited state. Nevertheless, despite the study of the photophysics of thioflavin T, it has been shown relatively recently in the literature that the kinetics of the change in the lifetime of the excited state and the fluorescence intensity of thioflavin in the formation of fibrils differ significantly, which is not fully consistent with the generally accepted picture. Thus, the lifetime of the excited state of thioflavin grows at the initial stages of fibril formation and reaches the plateau when the fluorescence intensity only begins to grow appreciably. It was suggested that the lifetime and fluorescence intensity of thioflavin are sensitive to different protein structures, respectively, different physical processes underlie their changes, but there is no explanation for this effect in the literature. As a hypothesis to be verified as a result of the implementation of this project, a different effect of the parameters of the microenvironment on the rate of radiation and nonradiative attenuation of the excited state of thioflavin T is considered, as well as their relation to the features of the binding sites of thioflavin in fibrillar structures of different morphologies. The project will accomplish this task, on the basis of which new approaches will be developed to diagnose fibrillar structures using fluorescent probes, in particular, to solve the actual biomedical problem of fibril detection in the early stages of their formation.

- Исследование спектров поглощения и флуоресценции тиофлавина Т и его производных, встроенных в амилоидные фибриллы, на различных стадиях образования фибрилл. Измерение кинетики затухания флуоресценции тиофлавина Т и его производных инкорпорированных в амилоидные фибриллы на различных стадиях их образования. Определение средней длительности затухания флуоресценции. В качестве модельных объектов на первом году выполнения проекта будут использованы амилоидогенные белки - инсулин, лизоцим, и, возможно, инуклеин и амилоидогенные пептиды. - Определение квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т и его производных, встроенных в амилоидные фибриллы, на различных стадиях образования фибрилл. - исследование причин различия кинетик изменения времени жизни и интенсивности флуоресценции тиофлавина при образовании фибриллярных наноструктур, проверка гипотезы об изменении скорости радиационной дезактивации возбужденного состояния тиофлавина Т при образовании бета-структур. ). - написание статьи в высокорейтинговый журнал (импакт-фактор не менее 2), участие в конференциях 2018-й год - Разработка протокола для диагностики фибриллярных структур, образующихся при агрегации аминокислоты фенилаланина, с использованием тиофлафина Т. Исследование фотофизических свойств тиофлавина при встраивании его в «неклассические», то есть состоящие не из амилоидогенных белков, фибриллярные структуры - Расчет константы радиационного перехода для молекул тиофлавина Т и его производных, встроенных в амилоидные фибриллы, на различных стадиях их образования. Создание модели встраивания молекул красителя в протофибриллы. - Разработка и верификация оптического метода детектирования фибриллярных структур на ранних стадиях их образования (протофибрилл) с использованием тиофлавина Т и его производных - Проведение экспериментов по FLIM (Fluorescence lifetime imaging) с фибриллами. Получение FLIM-изображений фибрилл на разных стадиях их формирования, соотнесение определенных типов фибриллярных структур с распределением по временам жизни флуоресценции - проверка гипотезы о повышении локальной концентрации тиофлавина Т (димеризации) при встраивании его в амилоидные фибриллы - Написание двух статей в высокорейтинговый журнал (импакт-фактор не менее 2), участие в конференциях

развит оригинальный метод нелинейной флуориметрии применительно к ароматическим аминокислотам [1] и триптофансодержащим белкам [2]. Далее, была разработана модель, позволяющая определять скорость внутримолекулярного переноса энергии в белковых макромолекулах, в частности, в флуоресцентных белках [3-4]. Обзор разработанной методики можно найти в главе в книге [5]. Метод нелинейной флуориметрии может быть применен для оценки скорости переноса энергии между одинаковыми флуорофорами, находящимися в возбужденном состоянии (эффект синглет-синглетной аннигиляции, наблюдаемый при высокой локальной концентрации флуорофоров, например, при агрегации молекул или при встраивании двух молекул-флуорофоров в непосредственной близости друг от друга в фибриллярную наноструктуру) и будет использован в данном проекте для исследования особенностей встраивания молекул тиофлавина в фибриллы.