Строение и регуляция длины теломерНИР

Telomere structure and length regulation

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 11 апреля 2017 г.-31 декабря 2017 г. Строение и регуляция длины теломер
Результаты этапа: Планы на 2017 выполнены в полной мере. Мы оценили сродство N-концевого домена Rif1 (NRif) к разным ДНК-субстратам in vitro. Обнаружено, что NRif обладает некоторым предпочтением к одноцепочечной теломерной ДНК по сравнению с двуцепочечной ДНК, но это свойство маскируется значительной степенью неспецифического связывания. Подтверждён экспериментально факт отсутствия выраженной вторичной структуры у N-концевого домена Rif1. Измерена длина теломер в штамме с удалённым N-концевым доменом Rif1. Теломеры в таком штамме удлиняются по сравнению со штаммом дикого типа. В то же время они не становятся такими же длинными, как в штамме с удалённым геном RIF1. Это говорит о том, что N-концевой домен необходим для выполнения функций Rif1, но не является полностью критическим компонентом белка. Также мы измерили длину теломер в штамме NRif-НА. В этом штамме теломеры оказались той же длины, что и в rif1. Значит, ингибирующей теломеразу функции у этого домена нет, и по всей видимости он нужен только для привлечения Rif1 на теломеры. Найдены аминокислотные остатки, замена которых приводит к потере взаимодействия NRif с ДНК in vitro. Проверено, что внесение таких замен в Rif1 приводит к снижению его ассоциации с теломерами и их удлинению. Таким образом, за первый год выполнения проекта мы проверили возможность того, что Rif1 привлекается на теломеры H. polymorpha за счёт взаимодействия его N-концевого домена с теломерной ДНК напрямую. Мы получили ряд подтверждений данной гипотезе, однако на основании полученных за первый год проекта результатов трудно сделать однозначный вывод о том, что именно ДНК-связывающая активность N-концевого домена обеспечивает теломерную локализацию Rif1, поэтому мы решили провести дополнительные эксперименты по установлению функции N-концевого домена Rif1.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Строение и регуляция длины теломер
Результаты этапа: В 2018 году мы изучили белки, предположительно связанные с двуцепочечной частью теломер H. polymorpha – Rap1A и Rap1B. Мы получили оба белка в рекомбинантной форме и изучили специфичность узнавания ДНК белками in vitro. Полученные результаты показали, что Rap1B связывает теломерные повторы, а Rap1A – связывается с коротким сайтом в субтеломерной области H. polymorpha. Были определены константы, характеризующие взаимодействие белков Rap1A и Rap1B с теломерными ДНК из различных видов дрожжей, что позволило сделать вывод о том, что Rap1A и Rap1B имеют различную специфичность к ДНК субстратам. При помощи гель-шифт метода мы проверили полученный ранее штамм deltarap1B. Оказалось, что белок Rap1B всё-таки присутствует, т.е. штамм не является нокаутным. Тогда для того, чтобы выявить потенциальное влияние Rap1B на длину теломер, мы получили штаммы с делециями С-концевых аминокислот Rap1B и обнаружили, что такие мутации приводят к удлинению теломер (преимущественно за счёт рекомбинации теломерной ДНК). Мы создали штамм moxNRif-HA, в котором экспрессия тагированного NRif находилась под контролем сильного индуцируемого промотора гена метанол-оксидазы (MOX), нативный локус Rif1 при этом оставался целым. Анализ длины теломер в таком штамме показал, что NRif-HA не способен вытитровать Rif1 с теломерной ДНК в клетках, даже когда он находится в избытке по сравнению к Rif1. Значит, N-концевой домен Rif1 по всей видимости не является самостоятельным модулем привлечения Rif1 на теломеры и для прочного взаимодействия нужны дополнительные участки белка. Мы также исследовали возможность того, что для активации теломеразы на теломерах необходима киназа Mec1. Мы обнаружили, что в штамме mec1 теломеры немного короче, чем в штамме дикого типа. Следовательно, ингибирующее действие Rif1 на теломеразу может быть опосредовано киназой Mec1 – гипотеза, которую мы планируем проверить в следующем году.
3 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Строение и регуляция длины теломер
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".