ИСТИНА

Проект направлен на решение фундаментальной проблемы: исследование механизмов повреждения и гибели нейронов при ишемии, травме головного мозга и ряде других патологических состояний, связанных с энергетическим голоданием нейронов и развитием глутаматной токсичности, что связано, в конечном итоге, с созданием стратегии по уменьшению функциональных нарушений и снижению гибели нейронов при этих патологических состояниях. Задачей настоящего проекта является исследование роли митохондрий и нарушения ионного баланса двухвалентных катионов Zn2+, Cu2+, Са2+ в механизмах повреждения и гибели нейронов с использованием клеточных систем, моделирующих процессы гибели клеток при энергетическом голодании и глутаматной токсичности, которые являются основными первичными звеньями развития гибели нейронов при ишемии и травме головного мозга. Актуальность задачи связана с тем, что в последние годы появились новые данные, что ионы меди и цинка в микромолярных концентрациях присутствуют в синаптических пузырьках нейронов коры головного мозга и наряду с кальцием могут участвовать в повреждении таких важнейших для жизни клеток органелл, как митохондрии.

The project is directed to the solution of a fundamental problem: a research of mechanisms of damage and death of neurons at ischemia, an injury of a brain and some other the pathological states connected with power starvation of neurons and development of glutamate toxicity that is connected, finally, with creation of strategy for reduction of functional violations and decrease in death of neurons at these pathological states. A task of the present project is the research of a role of mitochondrions and violation of ionic balance of bivalent cations of Zn2+, Cu2+, Ca2 + in mechanisms of damage and death of neurons with use of the cellular systems modeling processes of death of cages at power starvation and glutamate toxicity which are the main primary links of development of death of neurons at ischemia and an injury of a brain. Relevance of a task is connected with the fact that in recent years there were new data that ions of copper and zinc in micromolar concentration are present at synoptic bubbles of neurons of a cerebral cortex and along with calcium can participate in damage of such the cages of organellas, major for life, as mitochondria.

хелаторов этих металлов на нейрональную гибель нейронов, вызванную, гиперактивацией глутаматных рецепторов, гипогликемией и гипоксией . Эта стадия исследования является основополагающей для дальнейшего хода работ, которые позволят показать взаимосвязь нарушения внутриклеточного баланса ионов меди и цинка с нарушением структуры и функции митохондрий как основы аэробной энергетики нейронов. Это исследование оригинально и приоритетно, так как если в настоящее время роль ионов кальция в повреждении митохондрий при ишемии головного мозга подробно исследована, то знания о роли цинка, тем более меди в этих процессах фрагментарны и недостаточны. Большинство ожидаемых результатов исследования будет получено впервые.

В предыдущие годы нашей группой одной из первых в мире было показано, что гиперстимуляция глутаматных рецепторов культивированных нейронов вызывает кальцийзависимую деэнергизацию митохондрий. Замена внеклеточного натрия сахарозой значительно усиливает процесс деэнергизации и набухание митохондрий при гиперстимуляции глутаматных рецепторов, указывая, на то, что в поддержании ионного гомеостаза в цитоплазме и митохондрии играет важную роль система Na/H обмена Показано, что транзиторная глюкозная депривация вызывает обратимое снижение мембранного потенциала митохондрий и кальциевую перегрузку нейрона, которая не зависит от активации глутаматных рецепторов, но предотвращается митохондриальными энергетическими субстратами такими как пируват и глутамин. Показано, что ацидоз вызывает гибель культивированных зернистых нейронов, которая связана с цинковым дисбалансом цитоплазмы этих нейронов, что ведет к ингибированию первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и развитию окислительного стресса. Было обнаружено, что субтоксические концентрации Zn2+ способны потенцировать токсичность каината, приводя к набуханию нейрональных митохондрий 2. Показано, что в отсутствие глюкозы ZnCl2 уменьшал выживание нейронов. Блокада NMDA-подтипа ионотропных глутаматных рецепторов, а также внесение в раствор блокатора транспорта Са2+ в митохондрии рутениевого красного, полностью защищали культивированные зернистые нейроны от повреждающего действия ZnCl2 во время глюкозной депривации. В то же время, NBQX (блокатор AMPA/каинатных подтипов глутаматных рецепторов) не оказывал защитного эффекта. При глюкозной депривации уже за 1,5 ч в нейронах происходило значительное повышение внутриклеточной концентрации кальция ([Са2+]i) и менее выраженное – внутриклеточной концентрации цинка ([Zn2+]i). Добавление ZnCl2 в раствор вызывало рост [Zn2+]i как в отсутствие, так и в присутствии глюкозы, тогда как повышение [Са2+]i при этом наблюдалось только при глюкозной депривации и предотвращалось МК 801.

Ранее было продемонстрировано, что при энергетическом голодании токсическое действие ионов цинка на нейроны возрастает [Isaev et al., 2012]. Мы предположили, что в условиях энергетического дефицита токсичность ионов меди подобно цинку может возрастать. Глюкозная депривация вызывала быстрое снижение мембранного потенциала митохондрий, но не влияла в течении 2-3 часов на выживаемость культивированных зернистых нейронов мозжечка крыс. Хлорид меди (0.01 мМ, 2 ч) при внесении в глюкозосодержащий инкубационный раствор также не снижал выживаемости этих нейронов. Токсическое действие ионов меди сказывалось на выживаемости нейронов, когда их концентрация превышала 0,03 мМ. Однако, если медь вносили в инкубационный раствор на фоне глюкозного голодания, этот ион вызывал интенсивную гибель нейронов, которую частично предотвращал МК-801 - блокатор каналов, ассоциированных с глутаматными ионотропными рецепторами NMDA-подтипа и полностью предотвращал антиоксидант апцетил-цистеин и специфический хеллатор ионов цинкап, N,N,N',N'-тетракис(2-пиридилметил)этилендиамин (TPEN). Измерение уровня внутриклеточного кальция, цинка и окислительного стресса, используя соответствующие флуоресцентные зонды Fluo-4 AM, FluoZin-3 AM и CellROX Grin показало, что часовая глюкозная депривация вызывала интенсивное увеличение флуоресценции кальциевого зонда Fluo-4 и небольшое CellROX Grin, но не зонда на ионы цинка FluoZin-3. Добавление на фоне глюкозной депривации 0,01 мМ хлорида меди приводило к интенсивному росту флуоресценции всех 3-х зондов. MK-801 частично снижал вызванное медью увеличение флуоресценции Fluo-4, но не влиял на флуоресценцию FluoZin-3 и CellROX. Эти результаты демонстрируют, что ионы меди при энергетическом голодании нейронов вытесняют ионы цинка из мест их связывания в системах депонирования, усиливают продукцию свободных радикалов, далее все эти процессы суммарно способствуют выбросу глутамата, гиперактивации NMDA-подтипа глутаматных рецепторов, увеличению кальциевой перегрузки, что в конечном итоге вызывает гибель нейронов.