![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Проект направлен на выяснение молекулярного механизма электрогенного переноса протонов и сопряжения его с переносом электронов в терминальных дыхательных оксидазах. Цитохромоксидаза, важнейший представитель терминальных оксидаз, является одним из ключевых звеньев электрон-транспортных цепей митохондрий и бактерий, обеспечивая каталитическое восстановление кислорода до воды и образование протон-движущей силы на сопрягающей мембране. Каталитический цикл цитохромоксидазы включает в себя редокс-зависимую перекачку протонов через мембрану в режиме протонного насоса, молекулярный механизм работы которого не известен. Основная задача проекта состоит в идентификации промежуточных стадий переноса электронов и протонов в ходе каталитического цикла цитохромоксидаз митохондрий и бактерий с использованием как нативных, так и полученных с помощью направленного мутагенеза ферментов с заменами ключевых функционально значимых аминокислотных остатков. Наибольшее внимание предполагается уделить исследованию молекулярного механизма цитохромоксидазы митохондрий, включая выяснение траекторий проведения протонов, функциональной роли протон-проводящих путей, особенностей сопряжения перекачивания протонов с катализируемой реакцией восстановления кислорода. Работу предполагается выполнять с использованием различных методов спектроскопии и электрометрии с высоким временным разрешением.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2015 г.-24 декабря 2015 г. | Исследование молекулярного механизма сопряженного переноса протонов и генерации мембранного потенциала цитохромоксидазой. |
Результаты этапа: Подобраны условия культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Проведены мсштабные выращивания клеток рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Препараты будут использованы далее для получения препарата очищенной цитохромоксидазы методом афинной хроматографии. Проведено исследование разрешенных во времени стадий каталитического цикла цитохромоксидазы ba3-типа из T.thermophilus в диком типе и мутантной форме T315V с заменой в протон-проводящем К-каналe. Показано, данный остаток в протон-проводящем канале К критически важны для переноса перекачиваемых протонов через мембрану. Проведено исследование взаимодействия хинолоксидазы bd из Escherichia coli с пероксинитритом. Хинолооксидаза bd-типа обнаружена во многих бактериях, в том числе и патогенных, способствуя их вирулентности. Пероксинитрит (ONOO−) - химически активное и опасное соединение, продуцируемое хозяином для подавления внедрившихся микроорганизмов. Получены указания на защитную роль хинолокислазы bd от повреждающего действия пероксинитрита. C помощью многоволновой микросекундной спектрофотометрии исследована рекомбинация CO после фотолиза из биядерного центра bd оксидазы из E. coli в состоянии смешанной валентности и в полностью восстановленном состоянии при возбуждении на длине волны 532 нм. Обнаружено, что фотодиссоциация CO от фермента в состоянии смешанной валентности вызывает быстрый (~1.5 мкс) перенос электрона от гема d к гему b595, неописанный ранее. В отличие от полностью восстановленного состояния хинолооксидазы bd, в состоянии смешанной валентности наблюдаемые изменения спектра поглощения, связанные с диссоциацией CO от гема d, незначительны либо отсутствуют вовсе. Предполагается, что фотодиссоциация CO от гема d в состоянии смешанной валентности сопровождается немедленным связыванием эндогенного лиганда с противоположной стороны гема. | ||
2 | 1 января 2016 г.-22 декабря 2016 г. | Исследование молекулярного механизма сопряженного переноса протонов и генерации мембранного потенциала цитохромоксидазой. |
Результаты этапа: Разрешена кинетика генерации мембранного потенциала и проведено исследование электрогенного механизма перекачивания протонов в протеородопсине из Exiguobacterium sibiricum (ESR). Разработанные методы эффективного получения протеолипосом со встроенным ESR позволили получить максимальное значение амплитуды генерируемого ESR мембранного потенциала ~40 мв на импульс лазера, что сопоставимо с таковой для бактериородопсина из Halobacterium salinarum (BR). Показано, что в фотоцикле ESR образование интермедиата М (перенос протона от основания Шиффа к первичному акцептору протона Asp85) сопровождается двумя положительными по направлению электрогенными фазами (с t~3 мкс и ~40 мкс, соответственно) с суммарной амплитудой ~9% от полной величины генерируемого мембранного потенциала. Данное значение в ~3 раза меньше вклада соответствующей компоненты образования интермедиата M в BR, включающей в себя дополнительно выход протона от Arg82 во внешнюю среду. Электрогенные фазы и переходы фотоцикла ESR, связанные с переносом протона к основанию Шиффа из внутренней водной фазы, происходят с характеристическими временами ~0.5 мс и ~4.5 мс и суммарной амплитудой ~54%. В отличие от BR, электрогенный перенос протона от первичного акцептора Asp85 во внешнюю среду происходит на последней стадии фотоцикла ESR (t ~15 мс) с амплитудой ~37%. Показано, что кинетика генерации мембранного потенциала в исходном состоянии цитохромоксидазы семейства B не зависит от присутствия окислителя. Выяснено, что редокс-потенциалы гема а3 и CuB цитохромоксидазы семейства A в исходном состоянии более положительны, чем в случае оксидаз семейства B, а активный центр цитохромоксидаз семейства А в исходном состоянии представляет собой смесь состояний: окисленного, одноэлектронной формы и состояний частичной восстановленности кислорода. Получены спектры с микросекундным временным разрешением и охарактеризованы кинетические параметры восстановления низко-спинового гема а от CuA при фотоиндуцированном переносе электрона в прокариотических цитохромоксидазах аа3 типа семейства А. Показано, что обратный перенос электронов от гема d на гем b в медь-несодержащих терминальных оксидазах, вызванный фотолизом CO от одноэлектронной формы фермента, состоит из двух кинетически различных фаз. Установлению электронного равновесия между гемами с t ~16 мкс предшествует ранее неотмеченная субмикросекундная компонента переноса электрона между гемами. В медь-несодержащей терминальной оксидазе не выявлен перенос электрона в наносекундной временной шкале, характерный для гем-медных терминальных оксидазах и происходящий с характеристическим временем ~0.7 нс. | ||
3 | 1 января 2017 г.-29 декабря 2017 г. | Исследование молекулярного механизма сопряженного переноса протонов и генерации мембранного потенциала цитохромоксидазой. |
Результаты этапа: Цитохромоксидаза ba3 из T.thermophilus относится к семейству B гем-медных терминальных оксидаз, представители которого характеризуются рядом структурно-функциональных особенностей, включая следующие: 1) использование единственного протон-проводящего пути (гомолога К-канала) для проведения всех протонов в ходе каталитического цикла; 2) сниженная усредненная эффективность сопряженной трансмембранной перекачки протонов (~ 1 перекачиваемый протон на 2 электрона, ~0.5 H+/e); 3) неспособность каталитического центра связывать внешние лиганды в окисленном состоянии. Изучена быстрая кинетика генерации мембранного потенциала при инъекции электрона с помощью комплекса трис(бипиридил)рутения в обычное окисленное состояние (O) и высокоэнергетическое окисленное состояние O(H) цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus. Охарактеризованы амплитудно-временные параметры набора разрешаемых во времени электрогенных фаз. При одноэлектронном восстановлении окисленного "отрелаксированного" состояния ba3 оксидазы из T. thermophilus (O → E переход) вычленены две электрогенные фазы с характеристическими временами ~ 14 мкс и ~ 290 мкс. В результате соотнесения фаз кинетики генерации мембранного потенциала с параллельной кинетикой спектральных изменений фермента, вызванных переносом электрона через гем b в биядерный каталитический центр, выяснена природа соответствующих электрогенных реакций. Первая фаза отражает перераспределение электронов между CuA и низко-спиновым гемом b. Медленная электрогенная фаза включает в себя два процесса. Во-первых, перераспределение электронов от CuA и гема b в биядерный центр на гем a3. Во-вторых, электрогенный перенос протонов, сопряженный с восстановлением гема a3. Проведен анализ и получена оценка вкладов каждого из этих процессов в амплитуду медленной электрогенной фазы. Полученная оценка расстояния электрогенного переноса протонов соответствует поглощению протона из внутренней водной фазы в биядерный центр, где происходит восстановление гема а3. Сделан вывод о том, что при восстановлении "отрелаксированного" окисленного состояния цитохромоксидаза ba3 из T.thermophilus ни транслокации перекачиваемого протона, ни восстановления CuB не происходит. В случае одноэлектронного восстановления окисленного "неотрелаксированного" состояния (O(H) → E(H) переход) разрешены три фазы генерации мембранного потенциала. Проведен анализ амплитудно-временных параметров разрешеннх электрогенных фаз и соотнесение их с параллельной кинетикой спектральных изменений гемовых центров фермента. Показано, что одноэлектронное восстановление фермента в состоянии O(H) сопровождается электрогенным восстановлением пары гемов (гем b и гем а3) от CuA в "быстрой" фазе (~ 22 мкс) и переносом протонов в "средней" и "медленной" электрогенных фазах (~ 0,185 мс и ~ 0,78 мс). Перенос протонов происходит сопряженно с перераспределением электронов от пары гем b/гем а3 на сайт CuB. Показано, что суммарная амплитуда "средней" и "медленной" электрогенных фаз цитохромоксидазы ba3 меньше ~ в 1.6 раза, чем в случае цитохромоксидаз семейства А, обладающих полной эффективной стехиометрией перекачивания протонов через мембрану (~1 H+/e). Сформулирована рабочая модель, согласно которой "средняя" и "медленная" электрогенные фазы связаны с переносом протонов из внутренней водной фазы к протон-загрузочному сайту (PLS) протонного насоса фермента. Эффективность загрузки PLS перекачиваемым протоном близка к таковой, что и в оксидазах семейства А. Однако, в момент, когда все введенные электроны достигают сайта CuB, заряд электрона на нем компенсируется практически полным обратным переносом протона из PLS в биядерный центр. В результате, наблюдающаяся эффективность перекачки протонов в переходе O(H)→ E(H) составляет ~ 0,1 H+/e. Сделано предположение о том, что снижение стехиометрии перекачивания протонов цитохромоксидазы ba3 из T.thermophilus может объясняться влиянием формирующегося в ходе эксперимента мембранного потенциала. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".