![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Цель проекта состояла в изучении влияния одиночного эл. импульса – потенциала действия (ПД) на пространственную организацию фотосинт. активности и мембранного транспорта Н+ в возбудимой растительной клетке (на примере Chara corallina), а также в выяснении связей между мембранным возбуждением, фотосинтезом и формированием пространственных структур. Методы исследования включали микрофлуориметрию с насыщающими вспышками света, анализ флуоресцентных изображений, микроэлектродные измерения рН, определение эл. проводимости плазматической мембраны, а также эл. стимуляцию клетки и локальное подведение фотостимула через тонкое оптическое волокно.
В ходе выполнения проекта обоснованы следующие положения. (1) Влияние ПД на фотосинт. активность клеток Chara в физиол. условиях и в присутствии заряженных редокс медиаторов (метилвиологен, МВ) опосредовано принципиально разными механизмами. В физиол. условиях генерация ПД усиливает неоднородность распределения фотосинт. активности, повышая нефотохимическое тушение (NPQ) только в области наружных щелочных зон; ключевую роль в этих изменениях играют возрастание уровня Са2+ в цитоплазме и подавление встречно направленных потоков Н+ через плазмалемму в разных участках клетки. В отличие от этого, генерация ПД в присутствии МВ необратимо сглаживает продольный профиль NPQ, вызывая тушение флуоресценции по всей клетке. В этом случае ключевую роль играет облегченное проникновение МВ в цитоплазму в момент генерации ПД и его каталитическое участие в переносе электронов от фотосистемы I на O2 и в создании ?рН. (2) Генерация ПД в участках клетки с высоким наружным рН вызывает почти 10-кратное возрастание эл. сопротивления плазмалеммы и диссипацию наружных щелочных зон. Это говорит о локально высокой Н+ (ОН–) проводимости плазмалеммы, которая инактивируется при генерации ПД, тем самым блокируя поступление в клетку Н+. (3) Восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом понижает проводимость плазмалеммы в щел. зонах, но стимулирует активность Н+-насоса в кислых зонах, что проявляется по изменениям сдвигов наружного рН и проводимости мембраны при генерации ПД. Это указывает на редокс регуляцию ионных каналов плазмалеммы и лабильность путей циркуляции круговых эл. токов в окружении клетки. (4) Установлена важная роль движения цитоплазмы (циклозиса) в генерации неоднородного профиля рН и в дальнодействующей регуляции фотосинтеза. В частности, показана асимметрия сдвигов наружного рН и флуоресценции хлоропластов по разные стороны от места приложения к клетке узкого светового луча. Соответственно, кратковременная остановка движения цитоплазмы при генерации ПД служит одним из важных факторов влияния мембранного возбуждения на фотосинтез и неоднородный профиль рН на поверхности клетки. (5) С помощью рН микроэлектродов и вакуолярной перфузии междоузлий C. corallina выявлено неоднородное пространственное распределение рН в вакуоле на свету и сглаживание профиля рН при затемнении. Вероятно, светозависимое формирование пространственных структур охватывает и тонопласт и центральную вакуоль. (6) По измерениям индукционных кривых флуоресценции, изменений поглощения Р700+ ([Delta]А810) и миллисекундной компоненты послесвечения целых и инфильтрированных листьев показана зависимость нециклич. и циклич. транспорта электронов в хлоропластах от условий предварительного освещения и величины ?рН на тилакоидных мембранах. Лабильные соотношения между СО2-зависимым и альтернативными потоками электронов могут способствовать формированию неравномерного распределения фотосинт. активности в клетках и тканях при однородном освещении и усилению этой неравномерности при генерации ПД.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 25 марта 2010 г.-31 декабря 2010 г. | Этап 2010 г. |
Результаты этапа: Изучали неоднородное распределение электрохим. свойств плазмалеммы и фотосинт. активности хлоропластов в возбудимых клетках водоросли Chara corallina. Прослежена динамика изображений флуоресценции хлорофилла и нефотохимического тушения (NPQ) после генерации потенциала действия (ПД) в физиол. условиях и при наличии в среде гидрофильного акцептора электронов метилвиологена (МВ). В физиол. условиях эл. возбуждение клетки усиливает неоднородное распределение флуоресценции за счет возрастания NPQ в области щелочных зон, а в присутствии МВ – вызывает необратимое выравнивание профиля NPQ в связи с тушением флуоресценции Fm’ по всей клетке. Сделан вывод, что влияние ПД на пространственное распределение фотосинт. активности в природных условиях и в присутствии МВ определяется разными механизмами. Хлоропласты фотосинтетически активных участков клетки защищены от поступления гербицида МВ мембранным барьером, однако барьерная функция снимается во время ПД. Тушение флуоресценции Fm', индуцируемое эл. возбуждением в присутствии МВ, наблюдали при конц-ии Са2+ в среде 0.1 мМ, но не при 2 мМ Са2+. Результаты указывают на вероятную конкуренцию между катионами Са2+ и МВ2+ за проникновение в клетку по ионным каналам возбудимой мембраны, а также на возможность направленного усиления и ослабления гербицидного действия МВ на модельном объекте – клетках Chara. С помощью локальных измерений сопротивления плазмалеммы (Rm) и pH у поверхности клетки показано, что остановка входящего потока Н+ в щел. участках междоузлия после генерации ПД сопровождается возрастанием Rm. Это означает, что участки мембраны в щел. зонах обладают высокой Н+(ОН–) проводимостью, которая создает основную нагрузку для Н+-насоса в покое и инактивируется после генерации ПД. Установлено, что восстановление SH-групп дитиотреитолом снижает проводимость мембраны в щел. зонах, но стимулирует активность Н+-насоса. По-видимому, модификация состояния SH-групп плазмалеммы и хлоропластов изменяет пути циркуляции круговых эл. токов в окружении клетки. Подавление транспорта Н+ и фотосинт. активности хлоропластов после генерации ПД может частично определяться замедлением обмена ионов и метаболитов через оболочку хлоропласта при остановке движения цитоплазмы на пике ПД. В связи с этим изучали роль циклозиса в создании неоднородных свойств плазмалеммы и слоя хлоропластов. Выявлена асимметрия формирования щелочных зон на границах локально освещаемого участка клетки Chara, которая связана с переносом активного интермедиата в потоке цитоплазмы из области освещения в область затенения. Сделан вывод, что интермедиат, движущийся с потоком цитоплазмы, оказывает существенное влияние на мембранный транспорт, функцию хлоропластов и образование пространственных структур. | ||
2 | 11 марта 2011 г.-31 декабря 2011 г. | Этап 2011 г. |
Результаты этапа: Анализ флуоресценции хлорофилла и транспорта Н+ на микроучастках междоузлий Chara corallina с использованием точечного и общего фонового освещения раскрывает важную роль течения цитоплазмы в механизме фотогенерации "щелочных и кислых зон" на поверхности клетки, в неоднородном распределении фотосинтетической активности и влиянии мембранной возбудимости на фотосинтез. Показано, что яркое локальное освещение участка клетки в дополнение к постоянной подсветке всего междоузлия слабым светом, вызывает асимметричные сдвиги наружного рН и флуоресценции хлорофилла по разные стороны от светового луча. Возникновение полярности в такой системе включает ряд стадий: (1) изменение состава цитоплазмы в ярко освещенной зоне вследствие обмена метаболитов через оболочку хлоропластов, (2) направленный перенос модифицированной цитоплазмы с потоком жидкости и (3) её воздействие на хлоропласты и плазмалемму в слабо освещенных зонах, расположенных ниже (но не выше) по течению цитоплазмы. Образование щелочной зоны в этой экспериментальной модели связано с физиологическим (фотосинтез), а не повреждающим действием света. Замедление циклозиса при обработке цитохалазином Б сопровождалось нарастающей задержкой формирования щелочной зоны, что подтверждает роль циклозиса (стадии 2) в образовании пространственных структур. Предложенный эксперим. подход выявил роль дальних межхлоропластных взаимодействий в регуляции фотосинтеза. Показано, что приложение сравнительно короткого (30–60 с) яркого светового импульса к небольшому участку клетки Chara может вызывать изменения флуоресценции и фотосинт. активности на значительном удалении (до 5–6 мм) от освещаемой области и с задержкой до 100 с после затухания светового импульса. Показано, что интермедиат, стимулирующий тушение флуоресценции вдали от зоны освещения, распространяется по клетке со скоростью движения цитоплазмы (~70 мкм/с). Сравнение световых кривых для квантового выхода переноса электронов через фотосистему II (КВ ФСII) при общем и локальном действии света равного спектрального состава выявило значительные различия этих кривых, а также более эффективную работу ФСII и всей нециклической цепи электронного транспорта в условиях локального освещения. Эти данные, а также стирание различий между световыми кривыми для общего и локального освещения при подавлении циклозиса цитохалазином говорят о том, что постоянный приток "темновой" цитоплазмы в зону умеренного освещения на границе света и тени повышает КВ ФСII и обеспечивает более высокую скорость фотосинт. транспорта электронов по сравнению с участками, находящимися в равных световых условиях вдали от границы света и тени. В случае точечного освещения влияние потенциала действия (ПД) на флуоресценцию хлорофилла проявлялось при более высоких интенсивностях света и в более широком их диапазоне, чем при общем освещении клетки. Полученные результаты говорят о том, что влияние ПД на флуоресценцию хлоропластов в условиях неравномерного (локального) освещения обусловлено двумя механизмами, один из которых опосредован повышением уровня Са2+ в цитоплазме и его влиянием на реакции цикла Кальвина, а другой связан с внезапной остановкой циклозиса и нарушением установившихся взаимодействий между затененными и освещенными частями клетки. | ||
3 | 19 апреля 2012 г.-31 декабря 2012 г. | Этап 2012 г |
Результаты этапа: Цель проекта состояла в изучении влияния одиночного эл. импульса – потенциала действия (ПД) на пространственную организацию фотосинт. активности и мембранного транспорта Н+ в возбудимой растительной клетке (на примере Chara corallina), а также в выяснении связей между мембранным возбуждением, фотосинтезом и формированием пространственных структур. Методы исследования включали микрофлуориметрию с насыщающими вспышками света, анализ флуоресцентных изображений, микроэлектродные измерения рН, определение эл. проводимости плазматической мембраны, а также эл. стимуляцию клетки и локальное подведение фотостимула через тонкое оптическое волокно. В ходе выполнения проекта обоснованы следующие положения. (1) Влияние ПД на фотосинт. активность клеток Chara в физиол. условиях и в присутствии заряженных редокс медиаторов (метилвиологен, МВ) опосредовано принципиально разными механизмами. В физиол. условиях генерация ПД усиливает неоднородность распределения фотосинт. активности, повышая нефотохимическое тушение (NPQ) только в области наружных щелочных зон; ключевую роль в этих изменениях играют возрастание уровня Са2+ в цитоплазме и подавление встречно направленных потоков Н+ через плазмалемму в разных участках клетки. В отличие от этого, генерация ПД в присутствии МВ необратимо сглаживает продольный профиль NPQ, вызывая тушение флуоресценции по всей клетке. В этом случае ключевую роль играет облегченное проникновение МВ в цитоплазму в момент генерации ПД и его каталитическое участие в переносе электронов от фотосистемы I на O2 и в создании ?рН. (2) Генерация ПД в участках клетки с высоким наружным рН вызывает почти 10-кратное возрастание эл. сопротивления плазмалеммы и диссипацию наружных щелочных зон. Это говорит о локально высокой Н+ (ОН–) проводимости плазмалеммы, которая инактивируется при генерации ПД, тем самым блокируя поступление в клетку Н+. (3) Восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом понижает проводимость плазмалеммы в щел. зонах, но стимулирует активность Н+-насоса в кислых зонах, что проявляется по изменениям сдвигов наружного рН и проводимости мембраны при генерации ПД. Это указывает на редокс регуляцию ионных каналов плазмалеммы и лабильность путей циркуляции круговых эл. токов в окружении клетки. (4) Установлена важная роль движения цитоплазмы (циклозиса) в генерации неоднородного профиля рН и в дальнодействующей регуляции фотосинтеза. В частности, показана асимметрия сдвигов наружного рН и флуоресценции хлоропластов по разные стороны от места приложения к клетке узкого светового луча. Соответственно, кратковременная остановка движения цитоплазмы при генерации ПД служит одним из важных факторов влияния мембранного возбуждения на фотосинтез и неоднородный профиль рН на поверхности клетки. (5) С помощью рН микроэлектродов и вакуолярной перфузии междоузлий C. corallina выявлено неоднородное пространственное распределение рН в вакуоле на свету и сглаживание профиля рН при затемнении. Вероятно, светозависимое формирование пространственных структур охватывает и тонопласт и центральную вакуоль. (6) По измерениям индукционных кривых флуоресценции, изменений поглощения Р700+ (?А810) и миллисекундной компоненты послесвечения целых и инфильтрированных листьев показана зависимость нециклич. и циклич. транспорта электронов в хлоропластах от условий предварительного освещения и величины ?рН на тилакоидных мембранах. Лабильные соотношения между СО2-зависимым и альтернативными потоками электронов могут способствовать формированию неравномерного распределения фотосинт. активности в клетках и тканях при однородном освещении и усилению этой неравномерности при генерации ПД. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".