ИСТИНА

Репликативный цикл вируса иммунодефицита человека включает в себя стадию встраивания вирусной ДНК в ДНК зараженной клетки. Этот процесс осуществляется вирусным ферментом – интегразой (ИН). Известно, что ИН узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними, формируя так называемую интасому, и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3’-концов каждой цепи. Далее ИН дополнительно связывает клеточную ДНК и осуществляет встраивание в нее укороченных концов вирусной ДНК. Детальный механизм интеграции до сих пор не известен, понятно только, что в процессе последовательного связывания разных молекул ДНК комплекс ИН с ДНК должен претерпевать структурные изменения. Только те ингибиторы ИН, которые взаимодействуют с комплексом ИН с вирусной ДНК и препятствуют связыванию клеточной ДНК, проявляют высокую активность in vivo. Недостаток знаний о структуре интасомы и ее структурных перестройках в процессе интеграции затрудняет возможность моделирования новых ингибиторов. Конкретной задачей проекта является выяснение особенностей структурной организации интасомы ВИЧ-1 в ходе двух этапов интеграции – 3’-процессинга и переноса цепи. В ходе выполнения проекта РФФИ № 08-04-01293 нами было сделано предположение, что после связывания клеточной ДНК N- и C-концевые домены двух разных молекул ИН должны определенным образом сместиться, чтобы изменить расположение концов вирусной ДНК и дополнительно удержать ДНК-мишень. Для подтверждения этой гипотезы планируется провести аффинную модификацию ИН ВИЧ-1 в ходе проведения реакций 3’-процессинга и переноса цепи с использованием набора аналогов ДНК-субстрата, содержащих реакционно-способные и фотоактивируемые группы. На основании анализа литературных данных будут предсказаны вероятные контакты ИН ВИЧ-1 с ДНК-субстратом, которые осуществляются в структуре интасомы на стадии 3’-процессинга и меняются при переходе к стадии переноса цепи. Модификации в структуру субстрата будут введены в места выбранных контактов. Изменение набора контактов ИН с ДНК-субстратом при переходе от стадии 3’-процессинга к стадии переноса цепи будет свидетельствовать о наличии и характере конформационных изменений в структуре интасомы ВИЧ-1 в процессе интеграции.

В ходе репликации ВИЧ-1 вирусный фермент интеграз (ИН) связывается с последовательности на концах вирусной ДНК, формируя так называемую интасому, и катализирует реакцию отщепления динуклеотидов с обоих 3’-концов. Далее ИН дополнительно связывает клеточную ДНК и осуществляет встраивание в нее вирусной ДНК. Только те соединения, которые препятствуют связыванию клеточной ДНК, являются эффективными ингибиторами интеграции in vivo. Однако к этим ингибиторам достаточно быстро развивается резистентность ВИЧ-1. Недостаток знаний о структуре интасомы ВИЧ-1 затрудняет создание новых типов ингибиторов, которые могли бы преодолеть лекарственную устойчивость вируса. Задачами проекта являлось изучение структурной организации интасомы и исследование влияния мутаций лекарственной устойчивости на активность ИН на разных этапах интеграции. Для решения первой задачи нами впервые предложен подход, основанный на направленном расщеплении ИН химически активными производными ДНК-субстрата. Считается, что структура интасомы ВИЧ-1 аналогична охарактеризованной РСА структуре интасомы другого ретровируса – prototypic foamy virus (PFV). Нами был проведен анализ структуры интасомы PFV и выбраны положения ДНК-субстрата, которые сближены с аминокислотными остатками ИН (положения 1, 7 и 11 процессируемой и положения 3 и 5 непроцессируемой цепи). В эти положения были введены остатки аналога тимидина, содержащие вместо 5-метильной группы ATCUN-пептид (Gly-Gly-His), способный хелатировать ионы Cu2+ и катализировать окислительную деструкцию ИН в комплексе с модифицированной ДНК. Для получения конъюгатов ДНК с ATCUN-пептидом был разработан новый метод, основанный на реакции циклоприсоединения между азид-содержащим ATCUN-пептидом и алкин-содержащим олигонуклеотидом. Установлено, что расщепления ИН PFV происходит в комплексе со всеми ATCUN-ДНК со сравнимой эффективностью, что подтверждает сближенность ATCUN-группы с аминокислотным остовом белка. Также синтезированы аналоги ДНК субстрата ИН ВИЧ, содержащие ATCUN-пептид в тех же положениях, что и субстрат ИН PFV. Анализ расщепления ИН ВИЧ-1 в комплексе с этими модифицированными ДНК показал, что эффективное расщепление достоверно происходило только при наличии ATCUN-пептида в 1-ом положении процессируемой цепи и 3-ем положении непроцессируемой цепи субстрата. Следовательно, только эти положения ДНК сближены с аминокислотным остовом белка. Полученный результат показывает, что ДНК-белковые контакты различаются в интасомах ВИЧ-1 и PFV. Также наши результаты указывают на то, что структура интасомы ВИЧ-1 более адекватно представлена моделью комплекса ИН ВИЧ-1 с ДНК и клеточным белком LEDGF (Michel F. et al EMBO J. 2009, 28, 980-991), чем структурой интасомы PFV. Для исследования влияния мутаций лекарственной устойчивости на активность ИН ВИЧ-1 были получены препараты ИН, содержащие мутации E92Q, N155H, G140S, Q148K, E92Q/N155H и G140S/Q148H, обеспечивающие устойчивость ВИЧ-1 к ралтегравиру - ингибитору первого поколения, и мутации G118R, E138K и G118R/E138K, которые появляются в структуре ИН при использовании ингибиторов интеграции второго поколения. Показано, что ни одна из введенных мутаций серьезно не влияет на ДНК-связывающая активность ИН. Каталитическая активность фермента в реакции отщепления динуклеотида наиболее сильно снижается (10% от активности исходного фермента) в случае аминокислотных замен Q148K, G118R, E92Q, E92Q/N155H и G118R/E138K. В реакции интеграции существенное снижение активности наблюдалось только для мутантов G140S, Q148K, G140S/Q148K и N155H. Таким образом, мутации лекарственной устойчивости по-разному влияют на активность ИН на разных этапах интеграции.