Создание системы направленной модификации ДНК на основе синтетического мультидоменного белка «цинковые пальцы» и ATCUN-пептидаНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2012 г.-31 декабря 2013 г. Создание системы направленной модификации ДНК на основе синтетического мультидоменного белка «цинковые пальцы» и ATCUN-пептида - первый год
Результаты этапа: За отчетный год были получены следующие результаты. 1. Методами молекулярного моделирования была исследована структура комплекса синтетического белка tRL18 с ДНК-лигандом, в результате чего была установлена оптимальная длина и структура линкера между белком tRL18 и ATCUN-пептидом в составе гибридного белка, которая составила 3 аминоксилотных остатка. Линкер было решено составить из аминокислот Gly-Gly-Pro, причем остаток пролина был введен для обеспечения контактов ATCUN-пептида с поверхностью ДНК. 2. Методом сайт-направленного мутагенеза в уже имеющуюся конструкцию pET15b_tRL18 была введена последовательность, кодирующая ATCUN-пептид и линкерный участок. Было получено два варианта конструкций: pET15b_ATCggh_tRL (ATCUN-пептид состава Gly-Gly-His) и pET15b_ATCgsh_tRL (ATCUN-пептид состава Gly-Ser-His). Вторая конструкция представляет собой неканонический варинат ATCUN-пептида. Вектор pET15b позволяет получать белки, несущие His6-tag на N-конце. Правильность всех конструкций была проверена методом секвенирования ДНК. 3. были получены Гибридные белки путем экспрессии в культуре E. сoli с последующей очисткой на Ni-NTA агарозе. Для связывания ионов меди необходимо, чтобы у ATCUN-группы была свободная N-концевая аминогруппа, поэтому связанный с Ni-NTA агарозой препарат белка обрабатывался тромбином для того, чтобы отщепить His6-tag и высвободить N-конец. Препараты обоих рекомбинантых белков, а также белка tRL18 дикого типа, удалось получить c чистотой до 80% в концентрациях 20-30 мкМ. 4. Была протестирована способность рекомбинантых белков осуществлять связывание ДНК-дуплекса, в качестве которого использовался олигонуклеотидных дуплекс (FAM-trg, 40 п.о.), несущий специфический для белка tRL18 сайт в окружении рандомной ДНК-последовательности. Методом торможения в геле было показано, что рекомбинантные белки образуют прочный специфический комплекс с дуплексом FAM-trg и что ATCUN-пептид не влияет на способность «цинковых пальцев» взаимодействовать с ДНК-лигандом. 5. Была исследована способность гибридных белков ATCUN-tRL18 вносить разрывы в олигонуклеотидном дуплексе, содержащем специфическую для tRL18 последовательность (FAM-trg, 40 п.о.). Было показано, что при добавлении к белкам ATCUN-tRL18 ионов Cu(II) происходит расщепление дуплекса с преимущественным образованием продуктов гибролиза в районе 2-4 нуклеотидных пар от сайта связывания tRL18.
2 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Создание системы направленной модификации ДНК на основе синтетического мультидоменного белка «цинковые пальцы» и ATCUN-пептида - второй год
Результаты этапа: Для того, чтобы исследовать эффективность сайт-направленного расщепления ДНК ATCUN-tRL18 гибридом, мы решили использовать плазмидную конструкцию, содержащую специфический сайт узнавания белка tRL18 (сайт trg), встроенный в открытую рамку считывания для зеленого флуоресцентного белка GFP. К тому же, нами была получена плазмидная конструкция для эукариотической экспрессии гибридного белка GGH-tRL18, а также конструкции для экспрессии отдельно пептида GGH и белка tRL18. Для того, чтобы ATCUN-пептид связывал ионы Cu(II), необходимо наличие свободной NH2-группы первого остатка глицина в Gly-Gly-His трипептиде. При экспрессии GGH-tRL18 в культуре E.Coli NH2-группа остатка глицина высвобождалась за счет специфического протеолитического отщепления His6-тага в процессе очистки белкового препарата. В случае эукариотической экспрессии мы дополнительно модифицировали конструкции путем добавления в них последовательности, кодирующей TEV-протеазу. Получающийся с такой конструкции полипептид содержал протеазу на N-конце, следом за которой располагался сайт расщепления для TEV-протеазы (ENLYFQ\G), причем последний остаток глицина в сайте также являлся первым остатком глицина в GGH-пептиде. На C-конце получающиеся полипептиды содержали антиген гемагглютинина вируса гриппа (НА-таг) для детекции получающихся белков методом иммуноблота. Мы предполагали, что при совместной трансфекции вектора GFP, содержащего сайт trg, и вектора, кодирующего гибридный белок GGH-tRL18, будет детектироваться снижение флуоресценции GFP в связи со специфическим расщеплением GFP-вектора. Для начала мы оценили эффективность экспрессии с полученных нами конструкций в культуре клеток HEK 293T. Добавление последовательности trg в открытую рамку считывания белка GFP практически не повлияло на накопление флуоресценции белка GFP. Это оценивалось с помощью подсчета количества флуоресцирующих клеток на высокоскоростном клеточном сортере. Экспрессия ATCUN-содержащих полипептидов детектировалась путем анализа лизатов трансфецированных клеток НЕК 293Т методом иммуноблота с антителами к НА-тагу. В полученных лизатах мы наблюдали как исходный полипептид TEV-GGH-tRL18, так и процессированную форму GGH-tRL18 (определялось по подвижности белков), причем количество процессированной формы увеличивалось при увеличении времени, прошедшего после трансфекции. Аналогичная закономерность была отмечена и для контрольных конструкций: TEV-GGH и TEV-tRL18. В то же время мы отметили повышенную смертность клеток при трансфекции полной конструкцией (TEV-GGH-tRL18) и конструкцией TEV-GGH, что может быть связано с высокой токсичностью ATCUN-пептида для клеток. Также, выход процессированной формы был довольно низким и не превышал ~10-15% от общего количества НА-маркированного белка (72 часа после трансфекции). После проверки эффективности экспрессии полученных нами конструкций по отдельности, мы провели ко-трансфекцию GFP-содержащего и ATCUN-содержащего векторов. Необходимо отметить, что ATCUN-пептид проявляет гидролитическую активность только в том случае, если он координирует ион двухвалентной меди. В нашем случае источником физиологической концентрации меди для клеток является фетальная бычья сыворотка, добавленная к среде в соотношении 1:9. Совместная трансфекция двух типов векторов не оказала значительного влияния на флуоресценцию GFP (в случае ко-трансфекции исходного GFP-кодирующего вектора, не содержащего сайта trg, и любой из трех плазмид TEV-GGH, TEV-tRL18, TEV-GGH-tRL18). В этих экспериментах мы также отметили повышенную токсичность GGH-содержащих конструкций. Совместная экспрессия с GFP-кодирующими векторами также не оказала значительного влияния на экспрессию НА-маркированных белков. Для восстановления ионов Cu(II) и генерации гидроксил-радикалов необходимо присутствие восстанавливающих агентов. Для этого к инкубационной среде мы добавляли аскорбиновую кислоту. К сожалению, в нашей системе нам не удалось детектировать значительного снижения флуоресценции GFP при совместной трансфекции trg-GFP и TEV-GGH-tRL18 векторов. Это может происходить по следующим причинам: а) высокая токсичность ATCUN-содержащих векторов и связанная с этим низкая экспрессия гибридных белков; б) низкая эффективность автопротеолиза исходного полипептида TEV-GGH-tRL18; в) недостаточно высокое сродство белка tRL18 к последовательности trg (ок. 30 нМ). Также необходимо отметить, что ионы меди в сыворотке преимущественно связаны с белками, так как свободная медь токсична для живых систем. В связи с этим, ATCUN-пептид в нашей системе вынужден конкурировать с белками-переносчиками меди. Таким образом, отрицательные результаты, полученные нами в представленных экспериментах, не могут однозначно свидетельствовать о неэффективности разработанной нами системы направленной модификации ДНК.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".