ИСТИНА

Выяснить, обладает ли цитохром bd Escherichia coli пероксидазной активностью по отношению к разным субстратам. Подробно изучить перекисное окисление цитохромом bd гваякола. Убедиться, что пероксидазная реакция хорошо воспроизводится и не зависит от того, чем инициируется, - добавкой фермента или перекиси водорода. Осуществить постановку различных контролей – в отсутствие фермента, либо одного из субстратов, - гваякола или перекиси водорода. Исследовать зависимость скорости перекисного окисления гваякола от концентрации цитохрома bd и перекиси водорода. Выяснить, носит ли зависимость скорости реакции от концентрации оксидазы и перекиси водорода линейный характер, не происходит ли инактивации фермента в области высоких концентраций перекиси водорода, не способен ли гваякол защитить цитохром bd от инактивации перекисью. Провести подробное исследование зависимости скорости пероксидазной реакции от концентрации гваякола. Выяснить, не наблюдается ли ингибирование реакции при высоких концентрациях гваякола. Выяснить, как пероксидазная активность цитохрома bd зависит от рН среды, при каком значении рН наблюдается максимальная скорость перекисного окисления гваякола. Изучить действие ингибиторов оксидазной активности фермента на его гваякол-пероксидазную активность. Выяснить, как гваякол влияет на препарат очищенного солюбилизированного цитохрома bd, с какой из форм фермента (оксигенированной, оксоферильной или полностью окисленной) он будет взаимодействовать.

Выяснено, что цитохром bd Escherichia coli обладает пероксидазной активностью по отношению к разным субстратам. Такие соединения как гваякол, ферроцен, бензогидрохинон и ферроцианид калия (при соотношении ферро- и феррицианида калия 1:10) не окисляются при добавлении к выделенному из E. coli цитохрому bd в аэробных условиях (т.е. не являются субстратами оксидазной реакции - восстановления молекулярного кислорода до двух молекул воды), однако при добавлении в среду перекиси водорода наблюдается окисление этих субстратов. Такую активность цитохрома bd с перекисью водорода в качестве акцептора электронов можно назвать пероксидазной. Гваякол является классическим субстратом в исследованиях пероксидаз и его перекисное окисление цитохромом bd было изучено более подробно. Добавление цитохрома bd к смеси гваякола и перекиси водорода вызывает быстрое появление узкого минимума около 419 нм и более медленное развитие широкой полосы поглощения в области 350-550 нм. С течением времени (в диапазоне десятка минут) развитие минимума при 419 нм замедляется. Общее увеличение экстинкции соответствует образованию продукта окисления гваякола, спектр поглощения которого имеет характерные максимумы при 400-410 и 450-475 нм. Узкий минимум при 419 нм может быть обусловлен как изменением спектра одного или нескольких гемов в ответ на добавку перекиси водорода, так и их разрушением в части молекул цитохрома bd. Несмотря на небольшую скорость, эта пероксидазная реакция хорошо воспроизводилась и не зависела от того, чем инициировалась, - добавкой фермента или перекиси водорода. При постановке различных контролей - в отсутствие фермента, либо одного из субстратов, - гваякола или перекиси водорода, изменения поглощения при той же длине волны и тех же временах инкубации не наблюдали. Таким образом, можно заключить, что имеет место ферментативное окисление гваякола по пероксидазному механизму. Исследована зависимость скорости перекисного окисления гваякола от концентрации цитохрома bd и перекиси водорода. В исследованном интервале концентраций фермента (0-0,2 мкМ) скорость перекисного окисления гваякола линейно возрастает с увеличением концентрации цитохрома bd. В области относительно низких концентраций перекиси водорода (до 8 мМ) реакция линейно ускоряется по мере увеличения концентрации Н2О2. Однако в области более высоких концентраций наблюдается инактивация цитохрома bd. Так, например, при 25 мМ перекиси водорода активность цитохрома bd снижается до нуля в течение нескольких минут после смешивания. Ввиду наблюдаемого эффекта ингибирования мы ограничились проведением экспериментов при относительно низких концентрациях перекиси водорода. Следует заметить, что ингибирование перекисью водорода в области высоких концентраций характерно для всех известных пероксидаз. Механизм ингибирования, по-видимому, заключается в постепенной деградации гема в результате атаки его кислородными радикалами. В то же время, по данным Кита и соавт., хинолоксидазная активность цитохрома bd ингибируется в присутствии 120 мМ перекиси водорода всего лишь на 50%, т.е. фермент оказывается гораздо устойчивее к действию Н2О2, чем в наших опытах. Возможно, это связано с защитой цитохрома bd субстратами. При низких концентрациях гваякола (меньше 200 мкМ) скорость пероксидазного окисления гваякола начинает довольно быстро падать со временем, т. е. наблюдается ингибирование перекисью водорода, тогда как при концентрации гваякола 1,3 мМ постоянная скорость реакции сохраняется в течение ~20 мин. Это наблюдение указывает на то, что гваякол защищает фермент от ингибирования перекисью водорода. Об этом же говорит и тот факт, что рост провала при 419 нм, который соответствует разрушению гемов перекисью, в присутствии гваякола замедляется. Защита субстратами от ингибирования перекисью водорода известна для многих пероксидаз. Проведено подробное исследование зависимости скорости пероксидазной реакции от концентрации гваякола. На зависимости скорости пероксидазной реакции от концентрации гваякола при постоянной концентрации H2O2 1.5 мМ можно условно выделить три участка: участок роста активности - до 0,5 мМ, участок насыщения – от 0,5 до 2,5 мМ и участок снижения активности с ростом концентрации гваякола – более 2,5 мМ, назовем его участком субстратного ингибирования. Начальный участок характеризуется линейной зависимостью скорости реакции от гваякола без каких-либо признаков насыщения. Концентрация гваякола, при которой скорость реакции достигает половины максимально возможной, составляет ~0,28 мМ. При высоких концентрациях гваякола наблюдается ингибирование реакции. Концентрация гваякола, вызывающая полумаксимальное торможение реакции, составляет ~5 мМ. Следует отметить, что ингибирование природным субстратом (хинолом) характерно и для убихинолоксидазной активности цитохрома bd. Пероксидазная активность цитохрома bd зависит от рН среды, обнаруживая максимальное значение при рН 7, что вполне соответствует данным Лоренса и соавт. о зависимости от рН хинолоксидазной активности очищенного солюбилизированного цитохрома bd E. coli. Изучено действие ингибиторов оксидазной активности фермента на его гваякол-пероксидазную активность. В качестве таких ингибиторов использовали цианид, пентахлорфенол, 2-н-гептил-4-гидроксихинолин-N-оксид, ионы цинка. Обнаружено, что действие ингибиторов на пероксидазную и оксидазную активность сходно. Цианид калия известен как ингибитор цитохрома bd, который, связываясь с гемом d, блокирует работу активного центра фермента. По данным Киты и сотр., 2 мМ цианид ингибируют оксидазную активность фермента на 50%. В нашей работе обнаружено, что цианид калия в концентрации 3 мМ ингибирует пероксидазную активность цитохрома bd на 50%. Остаточная активность (~30%) не подавляется цианидом при увеличении концентрации ингибитора вплоть до 40 мМ. Одна из вероятных причин неполного ингибирования может состоять в гетерогенности препарата, которая известна из литературы, но возможны и другие объяснения. Представители другого класса ингибиторов, такие как пентахлорфенол, ионы цинка и 2-н-гептил-4-гидроксихинолин-N-оксид подавляют хинолоксидазную активность цитохрома bd, нарушая работу центра связывания убихинола. Пентахлорфенол в концентрации 1,5 мМ, угнетающий оксидазную активность цитохрома bd на 61%, ингибирует пероксидазную активность фермента полностью. 2-н-гептил-4-гидроксихинолин-N-оксид в концентрации 100 мкМ также ингибирует пероксидазную активность сильнее (на 70%), чем оксидазную (44%). В то же время такой ингибитор оксидазной активности как ионы цинка не оказывал никакого влияния на пероксидазную активность фермента даже при концентрации 150 мкМ. С чем связано отсутствие ингибирования пероксидазной активности ионами цинка, пока не ясно. Можно предположить, что ионы цинка связываются с остатками гистидина либо карбоксильными группами белка, образующими водородные связи с двумя гидроксигруппами убихинола при его специфичном связывании в активном центре. Гваякол располагает всего одной гидрокси группой, к тому же частично экранированной метоксигруппой в о-положении, поэтому связывание его в хинолдегидрогеназном центре скорее всего имеет в основном гидрофобный характер и нечувствительно к блокированию цинком групп, образующих водородные связи с OH-групами убихинола. Выяснено, как гваякол влияет на препарат очищенного солюбилизированного цитохрома bd. Для этого изучали действие гваякола на спектр поглощения очищенного солюбилизированного цитохрома bd E. coli. Препарат цитохрома bd, прединкубированный в аэробных условиях ("окисленный на воздухе") содержит несколько форм фермента. Основная часть представлена оксигенированной формой (~60–70%), есть также фракции оксоферильной (~20–30%) и полностью окисленной (~5–10%) форм. Мы решили посмотреть, с какой из форм фермента будет взаимодействовать гваякол. Было найдено, что при добавлении гваякола происходит избирательное исчезновение оксоферильной формы фермента (развитие провала при 680 нм). Кроме того, наблюдается небольшой пик в области 590 нм и коротковолновый сдвиг полосы Соре. Небольшое увеличение экстинкции при 590 нм могло бы означать частичное восстановление гема b595. Соответствующие этому восстановлению изменения в полосе Соре (ожидаемый узкий максимум при ~440 нм) возможно являются причиной асимметрии наблюдаемого коротковолнового сдвига, принадлежащего главным образом гему d, где минимум при 440 нм существенно меньше максимума при 406 нм. Оксигенированная и окисленная формы фермента с гваяколом не взаимодействуют. Факт влияния гваякола на препарат цитохрома bd полезен с методической точки зрения, так как дает возможность удалять примесь оксоферрильной формы из аэробного оксигенированного препарата фермента, делая его более однородным.