ИСТИНА

1. Исследовать с временным разрешением цитохромоксидазу caa3 из Thermus Thermophilus (подсемейство А2 суперсемейства гем-медных терминальных оксидаз), как модельный объект для получения дополнительной информации о механизме работы цитохромоксидазы из митохондрий. К особенностям данного фермента относится ковалентно-связанный цитохром с, а также отсутствие ряда ключевых аминокислотных остатков в протон-проводящих каналах. Реакция окисления полностью восстановленных классических аа3 цитохромоксидаз кислородом в режиме одного оборота заканчивается полностью окисленным состоянием (O или OH). Дополнительный гемовый центр ковалентно связанного цитохрома с в caa3 оксидазе позволяет исследовать дополнительную одноэлектронную стадию (O->E) малоизученного начального участка каталитического цикла цитохромоксидазной реакции. Конкретной задачей является комплексное изучение кислород-редуктазной реакции и сопряженного электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе из подсемейства А2 с целью выявления сходства и различия в механизме сопряжения с классическими гем-медными оксидазами. 2. Продолжить исследование каталитического цикла малоизученной цитохромоксидазы ba3-типа из Thermus thermophilus, характеризующейся сниженной эффективностью сопряженной трансмембранной перекачки протонов. Целью является выяснить связь одноэлектронных переходов (OH->EH и EH->R) в восстановительной части каталитическом цикла цитохромоксидазы ba3 с трансмембранным переносом протонов, а также выявить ключевые аминокислотные остатки фермента, участвующие в переносе протонов в ходе каталитического цикла. 3. Продолжить изучение механизма сопряженного трансмембранного переноса протонов в классической цитохромоксидазе аа3 типа из Rhodobacter sphaeroides, включая мутантные формы с заменами в протон-проводящем D-канале, специфически ингибирующими протон-транспортные стадии. Основная цель заключается в выяснении на молекулярном уровне причин специфического отключения протонного насоса в ферменте, вызванного этими мутациями.

1. Исследована быстрая кинетика окисления кислородом полностью восстановленной цитохромоксидазы caa3-типа из Thermus thermophilus в ходе реакции с кислородом в режиме одного оборота фермента. В результате глобальной аппроксимации двумерного массива спектрально-кинетических данных, собранных в ходе реакции окисления полностью восстановленной caa3 оксидазы кислородом ([O2]~1 мМ), с записью полного спектра образца с временным интервалом 1-16 мкс, выявлены 6 переходов с характеристическими временами: 8 мкс, 30 мкс, 41 мкс, 2.7 мс, 70 мс и 500 мс. Разностный спектр первой кинетической компоненты (переход R->A) характеризуется уменьшением поглощения при 613 нм и увеличением поглощения при 598 нм и 557 нм, что отражает соответственно исчезновение несвязанной с лигандом восстановленной формы гема а3, и появление окси-комплекса или т.н. компаунда А (комплекса восстановленного железа гема а3 с кислородом). Выход состояния А значительно меньше, чем в случае цитохромоксидазы из митохондрий, что объясняется особенностями связывания окиси углерода в биядерном центре. В спектре второй кинетической фазы (переход A->P) уменьшение поглощения при 604 нм и широкий пик с максимумом поглощения при 623 нм характеризует окисление низко-спинового гема а и образование интермедиата P. Особенностью цитохромоксидазы caa3 из T.themophilus является сдвиг соответсвующих максимума и минимума поглощения в красную область спектра по сравнению с цитохромоксидазой из митохондрий, что объясняется структурными особенностями гема а3 в цитохромоксидазах ba3 и caa3 из данного организма (вместо фарнезильного заместителя - геранилгеранильный). Спектр третьей кинетической компоненты (переход P->F) характеризуется значительным уменьшением поглощения при 619 нм и появлением узкого пика с максимумом 603 нм, указывающим на вероятное ревосстановление низко-спинового гема а в этой фазе. Спектр четвертой компоненты характеризуется уменьшением поглощения при 606 нм и широким плечом с низковолновой стороны с минимумом около 585 нм, а также широкой полосой увеличения поглощения при 654 нм. Кроме того cпектр третьей и четвертой кинетических компонент характеризуется уменьшением поглощения при 549 нм и увеличением при 830 нм, что указывает на параллельное окисление CuA и гема цитохрома с. Спектр 5-й компоненты идентичен спектру 4-й и указывает на переход F->OH->E, происходящий с разными скоростями в двух фракциях фермента. Спектр 6-й компоненты (500 мс) отражает медленное окисление кислородом неактивной в фотолизной реакции популяции фермента, необразующей комплекс CO-гем а3. При моделировании соответствующих переходов фермента с помощью набора простых спектров отдельных гемовых компонентов реакции, установлено, что интермедиаты А, P, F, E цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus вцелом характеризуются спектральными характеристиками сходными с таковыми в цитохромоксидазе из митохондрий, учитывая вызванный структурными особенностями сдвиг в красную область спектра гема а3 в цитохромоксидазах из T. thermophilus. В отличие от предыдущих работ с временным разрешением на цитохромоксидазе caa3 типа, показано что предстационарное окисление полностью (5-ю электронами) восстановленного фермента заканчивается одноэлектронным состояние EH. В отличие от стационарного одноэлектронного состояния E цитохромоксидаз, состояние EH характеризуется высоким редокс-потенциалом CuB, в результате чего электрон локализуется исключительно на CuB. 2. Исследовалось предстационарная кинетика генерации мембранного потенциала в ответ на одноэлектронное фотовосстановление цитохромоксидазы ba3-типа из Thermus thermophilus из окисленного активированного состояния OH. Использовались 3 модификации фермента: 1) нерекомбинантная цитохромоксидаза ba3 Thermus thermophilus; 2) рекомбинантая ba3 оксидаза дикого типа, несущая добавленную последовательность из 6 остатков гистидина (что позволяет изолировать цитохромоксидазу из мембран с помощью высоко чувствительной афинной хроматографии); 3) мутантная ba3 оксидаза с единичной специфической заменой (D372I) в предполагаемом протон-проводящем пути, в результате которой наблюдается уменьшение стационарной кислород-редуктазной активности фермента. В предстационарной кинетике генерации мембранного потенциала, сопряженной с переходом OH->EH в цитохромоксидазе ba3-типа из Thermus thermophilus дикого типа (нерекомбинантной и рекомбинантной) разрешаются микросекундная и миллисекундная компоненты с характеристическими временами (~10-20 мкс и ~0.4-0.6 мс) и соотношением амплитуд (1:2). Быстрая электрогенная компонента обусловлена переносом электрона на низко-спиновый гем b от CuA, в то время как медленная фаза связана с переносом протона, сопряженного с реокислением гема b биядерным центром и переносом электрона на конечный акцептор электрона, CuB. По предварительным данным, мутация D372I в протон-проводящем пути цитохромоксидазы ba3 приводит к изменению соотношения быстрой и медленной электрогенных фаз в предстационарной кинетике генерации мембранного потенциала, что указывает на участие данного остатка и соответствующего протон-проводящего пути в проведении протонов в ходе каталитического цикла данной цитохромоксидазы. 3. Проведено сравнительное исследование предстационарных кинетик генерации мембранного потенциала и спектральных изменений гемовых центров при фотоиндуцированном одноэлектронном восстановлении гомологичных аа3 цитохромоксидаз из митохондрий и Rhodobacter sphaeorides. В то время как оптически регистрируемая кинетика окисления гема биядерным центром в митохондриальной и бактериальной гомологичных оксидазах совпадает во времени и характеризуется константой времени 1-1.5 мс, выявлены различия в скоростях электрогенных фаз переноса протонов в ферментах из разных организмов. В отличие от бактериального фермента, сопряженный электрогенный перенос протонов в цитохромоксидазе из митохондрий значительно отстает во времени от редокс-реакции (4-5 мс) и происходит, по-видимому, засчет сохраненной свободной энергии редокс-реакции в промежуточном напряженном конформационном состоянии фермента. Выявленные отличия могут свидетельствовать о различии механизма сопряженного электрогенного переноса протонов в родственных ферментах, относящихся соответственно к эукариотическим и прокариотическим организмам.