ИСТИНА

1. С помощью разрешенной во времени спектрофотометрии исследовать быструю кинетику окисления полностью восстановленной цитохромоксидазы caa3 из Thermus Thermophilus, относящуюся к подсемейству А2 семейства А, молекулярным кислородом в режиме одного оборота фермента. Реакция окисления полностью восстановленных классических аа3 оксидаз (относящихся к подсемейству А1 семейства А) кислородом в режиме одного оборота фермента заканчивается полностью окисленным состоянием (O или OH). Наличие дополнительного гемового центра ковалентно связанного цитохрома с в caa3 оксидазе дает возможность исследовать дополнительную одноэлектронную стадию (O->E) малоизученного начального участка восстановительной части каталитического цикла цитохромоксидазы. 2. Продолжить исследование малоизученного с функциональной точки зрения каталитического цикла цитохромоксидазы ba3-типа из Thermus thermophilus, для которой характерна сниженная эффективность сопряженной трансмембранной перекачки протонов. Целью является выяснить сопряжены ли одноэлектронные переходы (OH->EH и EH->R) в восстановительной части каталитическом цикла цитохромоксидазы ba3 с трансмембранным переносом протона, а также выявить ключевые аминокислотные остатки фермента, участвующие в переносе протонов в ходе каталитического цикла. Продолжить исследование прямым электрометрическим методом предстационарной кинетики одноэлектронного фотовосстановления цитохромоксидазы ba3-типа, переведенной в окисленное активированное состояние OH. 3. Продолжить изучение сопряженного электрогенного переноса протонов в классической цитохромоксидазе аа3 типа из Rhodobacter sphaeroides с мутациями D132N, N139L и N139D, специфически ингибирующими сопряженный электрогенный перенос протонов. Основная цель заключается в выяснении на молекулярном уровне причин специфического отключения протонного насоса в ферменте, вызванного этими мутациями.

1) С помощью разрешенной во времени спектрофотометрии и емкостной потенциометрии изучены в предстационарном режиме отдельные стадии переноса электронов и протонов в каталитическом цикле цитохромоксидазы caa3 из Thermus thermophilus. Для синхронизованного запуска электрон-транспортных процессов использовался фотолиз комплекса биядерного центра фермента с окисью углерода в присутствии молекулярного кислорода и в анаэробной среде. В ходе спектроскопических измерений были собраны массивы спектрально-кинетических данных с записью полного спектра образца в видимом диапазоне с временным интервалом 1-16 мкс. В аэробных условиях разрешена и охарактеризована кинетика окисления полностью восстановленной caa3 цитохромоксидазы из T.thermophilus молекулярным кислородом в режиме одно каталитического оборота фермента. Выявлены 6 переходов, пять из которых отражают последовательное превращение состояний каталитического центра R->A->P->F->OH->EH с характеристическими временами, соответственно: 8 мкс, 30 мкс, 41 мкс, 2.7 мс и 70 мс. Спектр 6-й компоненты (~500 мс) отражает медленное окисление кислородом популяции фермента, неактивной в реакции фотолиза. В отличие от классических цитохромоксидаз аа3-типа, наличие 5-го редокс-центра (цитохрома с) приводит к появлению в цитохромоксидазе caa3 дополнительного перехода OH->EH. Для цитохромоксидазы caa3-типа впервые показано, что образующееся в результате окисления полностью восстановленного фермента кислородом состояние является формой EH биядерного центра. В отличие от стационарного одноэлектронного состояния E типичных цитохромоксидаз, характеризующегося рапределением электронного эквивалента между разными редокс-центрами фермента, состояние EH обладает необычно высоким значением редокс-потенциала CuB. В результате, электронный эквивалент локализуется исключительно на CuB. 2) Для отслеживания векторной составляющей разрешенных стадий переноса электронов и протонов в белке, в параллельных измерениях использовался метод емкостной потенциометрии (электрометрических метод). В присутствии кислорода, в ответ на фотолиз окиси углерода от биядерного центра встроенной в протеолипосомы цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus, наблюдается генерация мембранного потенциала, соответствующая по знаку переносу положительного заряда изнутри липосом наружу. Амплитуда генерации мембранного потенциала критическим образом зависила от временного промежутка между смешиванием фермента с молекулярным кислородом и фотолизом. Измерение кинетики генерации потенциала ферментом в этих условия для разного временного промежутка между фотолизом и инъекцией кислорода, позволило определить константу спонтанной диссоциации CO от гема а3 цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus. Эта величина составляет ~0.37±0.025 c?1. В кинетике образования потенциала были разрешены теже промежуточные стадии, что и в спектрофотометрических измерениях. Высвобождение CO, связывание O2 и образование первичного оксикомплекса (состояние А) характеризуются лаг-фазой с ?~20–30 мкс. Вслед за этим в кинетике разрешается переход P->F, характеризующийся ?~50 мкс и относительной амплитудой ~30%. К переходам F->OH и OH->EH в каталитическом цикле фермента относятся 3 последовательные стадии генерации потенциала с временами и относительными амплитудами, соответственно: ~250 мкс (19%), ~1.4 мс (26%) и ~4 мс (20%). Проведена оценка относительных амплитуд компонент генерации мембранного потенциала, используя в качестве внутреннего стандарта величину электрогенного переноса электронов в обратном направлении в анаэробных условиях. В результате показано, что переход P->F цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus сопряжен с транмембранной транслокацией 2 зарядов, включая помпирование одного протона через всю толщину мембранного диэлектрика. Одновременно, переходы F->OH->EH сопряжены с переносом 4 зарядов через мембрану. Это означает, что перенос 5-го электрона в биядерный центр цитохромоксидазы caa3 из T.thermophilus сопряжен с трансмембранной перекачкой протона. 3) Было продолжено исследование малоизученного с функциональной точки зрения каталитического цикла цитохромоксидазы ba3-типа из T.thermophilus, для которой характерна сниженная эффективность сопряженной трансмембранной перекачки протонов. Целью является выяснить сопряжены ли одноэлектронные переходы (OH->EH и EH->R) в восстановительной части каталитическом цикла цитохромоксидазы ba3 с трансмембранным переносом протона, а также выявить ключевые аминокислотные остатки фермента, участвующие в переносе протонов в ходе каталитического цикла. Получены предварительные результаты по измерению быстрой кинетики генерации мембранного потенциала при инъекции в состояние OH для двух различных препаратов дикого типа цитохромоксидазы ba3, изолированных: i) из штамма T.thermophilus стандартным образом и ii) из мутантного штамма, несущего полигистидиновую последовательность на N-конце первой субъединицы, с помощью аффинной хроматографии. Использование данного штамма должно позволить значительно оптимизировать процедуру очистки белка, а также получения новых мутантных форм фермента со специфическими заменами аминокислот в протон-проводящих каналах. Для препаратов обоих типов показано, что кинетика генерации мембранного потенциала, сопряженная c переходом OH->EH в каталитическом цикле цитохромоксидазы ba3, характеризуется микросекундной (~10-30 мкс) и миллисекундной (~0.4-1 мс) компонентами c близким соотношением амплитуд. Быстрая электрогенная компонента сходна по скорости с переносом электрона на низко-спиновый гем b от CuA, в то время как медленная фаза связана с переносом протона, сопряженного с реокислением гема b биядерным центром и переносом электрона на CuB. 4) Было продолжено изучение сопряженного электрогенного переноса протонов в классической цитохромоксидазе аа3-типа из Rhodobacter sphaeroides. Основное внимание было уделено исследованию ферментов со специфическими мутациями, ингибирующими сопряженный электрогенный перенос протонов во входном протонном D-канале. В ходе изучения ряда препаратов мутантных цитохромоксидаз были получены препараты ферментов с одиночной заменой D132N, обладающие исходно высокоспиновым состоянием гема а3 и высокой способностью образовывать состояние F при добавлении перекиси водорода. Полученные ранее препараты данного мутанта характеризовались низкой способностью в реакции с перекисью водорода, что было обусловлено переходом гема а3 в низкоспиновое состояние в ходе очистки фермента из мембран. Выход состояния F в присутствие перекиси водорода может быть оценен по амплитуде сдвига спектра полосы Соре с максимумом 438 нм и минимумом 413 нм, возникающем в ответ на добавку к окисленному ферменту перекиси водорода. Сравнение этих значений с цитохромоксидазой дикого типа, показывает, что в мутантном ферменте амплитуда спектральных изменений полосы Соре в присутствие 2 мМ H2O2 составляет ~35-37мМ-1см-1. Данное значение близко к таковому в мутантном ферменте с заменой N139L и N139D и составляет ~70% от выхода состояния F в ферменте дикого типа. Использование данных препаратов мутанта D132N в дальнейшем, в экспериментах по одноэлектронной инъекции в фермент с помощью комплекса трис(бипиридил)рутения, должно способствовать детализации сопряженного переноса протонов внутри D-канала в переходе F->O каталитического цикла цитохромоксидазы.