ИСТИНА

Отечественный грант РФФИ №04-04-49507 «Молекулярные механизмы инициации трансляции мРНК ретротранспозона человека семейства L1» (1.01.2004 - 31.12.2006; Руководитель проекта – Дмитриев С.Е.)

Проект был посвящен исследованию молекулярных механизмов инициации трансляции мРНК ретротранспозона L1. Этот мобильный элемент, чьи многочисленные копии занимают более 17% хромосомной ДНК человека, кодирует уникальную бицистронную мРНК (см. Рис.1), которая является одновременно транспозиционным интермедиатом и матрицей для синтеза двух белков ретротранспозона. В ходе исследования нами было показано, что инициация трансляции обоих цистронов L1 осуществляется по кеп-зависимому механизму. Эти данные расходятся как с предсказаниями, которые были сделаны ранее в литературе рядом зарубежных исследователей, так и с нашими собственными первоначальными ожиданиями, поскольку, во-первых, сам факт наличия в мРНК двух цистронов, как правило, предполагает присутствие сайта внутренней посадки рибосомы (IRES), направляющего синтез второго белка, а во-вторых, длинная (более 900 нт) GC-богатая 5’-нетранслируемая область (5’-НТО), по существующим представлениям, должна делать трансляцию мРНК L1 крайне неэффективной – что в случае первого цистрона L1 было бы нелогично, т.к. он кодирует структурный белок РНП-частицы L1, необходимый ретротранспозону в больших количествах. Тем не менее, в ходе нашего исследования выяснилось, что мРНК L1 не содержит IRES-элементов. Трансляция второго цистрона происходит по механизму ре-инициации и по непонятным пока причинам слабо зависит от AUG-кодона. Эффективность этой ре-инициации крайне невысока. В то же время эффективность трансляции первого цистрона, напротив, оказалась неожиданно высокой, сходной с таковыми для мРНК с короткими 5’-НТО (например, мРНК бета-актина). Значительная (в два порядка) разница в уровнях инициации трансляции первого и второго цистронов мРНК L1 обеспечивает нужное соотношение количеств закодированных в них белков (структурного белка мРНП и обратной транскриптазы, соответственно). Обнаруженный факт высокоэффективной кеп-зависимой инициации трансляции первого цистрона является особенно интересным, поскольку он совершенно не укладывается в рамки классической «сканирующей» модели. Нам удалось показать, что длинная структурированная 5’-НТО мРНК L1 (см. Рис.2), содержащая к тому же две коротких uORF, полностью «просматривается» (сканируется) инициирующей рибосомой, однако это нисколько не снижает эффективности работы такого лидера. Делеционный анализ не выявил в составе 5’-НТО никаких важных детерминант, которые позволили бы говорить о каком-то особом механизме (например, «шунтировании» центральной части 5’-НТО), поэтому наши результаты становятся очередным поводом для пересмотра устоявшихся представлений о пути кеп-зависимой инициации трансляции и факторах, влияющих на эффективность этого процесса. Другим важным результатом нашей работы являются новые критерии, разработанные нами для оценки наличия/отсутствия в той или иной мРНК IRES-элементов. Эти критерии, возможно, заставят пересмотреть представления о наличии IRES’ов во многих длинных и сложно устроенных лидерах клеточных мРНК. В ходе выполнения проекта нам пришлось также столкнуться с недостаточной изученностью организации внутреннего промотора ретротранспозона L1. Этот промотор расположен в 5’-НТО мобильного элемента. До сих пор считалось, что ключевые детерминанты, отвечающие за его работу, локализуются преимущественно в первых 100 нт 5’-НТО L1 (т.н. «минимальный промотор»). Однако наши данные однозначно свидетельствуют, что для транскрипционной активности ретротранспозона L1 наибольшую значимость имеет вовсе не район «минимального промотора», а внутренняя область 5`-НТО (+400 - +580). В этой области сосредоточены множественные сайты связывания факторов транскрипции, и она способна стимулировать активность «минимального промотора» ретротранспозона, будучи удаленной от него на расстояние более 2.5 т.н.о. Таким образом, данный участок может играть роль уникального внутригенного энхансера. Кроме того, в отсутствие «минимального промотора» он может самостоятельно направлять транскрипцию, выполняя функции альтернативного промотора. Полученные нами данные позволяют провести аналогии между организацией промоторной области ретротранспозона L1 человека и структурой регуляторных участков других LINE-ретротранспозонов – в частности, хорошо изученных промоторов мобильных элементов беспозвоночных. Прежде было принято считать, что структура промоторных областей элементов этих двух групп принципиально различна.