ИСТИНА

Работы, проведенные ранее в нашей группе, позволили нам установить, что белок Aim23p является третьим фактором инициации трансляции в дрожжевых митохондриях (ранее такой фактор был неизвестен). В качестве одного из доказательств функции данного белка мы создали штамм дрожжей с делецией гена AIM23 и оценили его митохондриальную функцию. Из научной литературы известно, что делеции генов белковых факторов митохондриальной трансляции приводят к потере функциональности митохондрий: органеллы перестают потреблять кислород, не генерируют мембранный потенциал, останавливаются все биохимические процессы, в результате чего чаще всего происходит полная потеря генома органелл. Проводя наши эксперименты, мы ожидали получить такие же результаты. Однако нас ожидал сюрприз: если в первые 1-2 дня роста клетки-делетанты действительно характеризовались серьезными нарушениями митохондриальной функции, то к 4-му дню роста такие клетки каким-то образом адаптировались к отсутствию Aim23p, и функция их митохондрий восстанавливалась практически до нормальной. Данный проект направлен на описание молекулярных механизмов подобной адаптации.

Были получены кривые роста штамма дрожжей дикого типа и штамма-делетанта по гену AIM23 на среде с глицерином. Оказалось, что в первые 24 часа клетки штамма-делетанта растут медленнее, чем клетки дикого типа, но к концу третьих суток инкубации разница в росте исчезает. Таким образом, подтвержден процесс адаптации дрожжевых клеток к отсутствию белка Aim23p со временем. Были получены и проанализированы профили митохондриальной трансляции клеток штамма-делетанта по гену AIM23 в различные временные точки (до адаптации, в момент адаптации, после адаптации). Эти профили сильно отличались друг от друга для штамма дикого типа и штамма-делетанта. В последнем количество белков Var1p и Cob было сравнимо с таковым в штамме дикого типа, количество белков Cox1p, Cox2p и Cox3p было значимо меньше такового в штамме дикого типа, а количество белков Atp6р, Atp8р и Atp9р - напротив, в несколько раз больше по сравнению со штаммом дикого типа. При подсчете количества митохондриальных мРНК в клетках штамма-делетанта по гену AIM23 оказалось, что для каждого митохондриального гена количество его мРНК практически не отличается от такового в клетках дикого типа. Таким образом, различие в количествах индивидуальных митохондриальных белков не могут быть объяснены эффектами на уровне транскрипции. Проведен полногеномный анализ количеств клеточных мРНК в клетках штамма-делетанта по гену AIM23 («RNA-seq»). Был проведен отбор мРНК – кандидатов, белковые продукты которых, возможно, обеспечивают адаптацию клеток штамма-делетанта к отсутствию белка Aim23p. Наиболее сильные изменения количества были детектированы для двух мРНК: фактора элонгации трансляции и белка Tma19p. К сожеланию, делеция фактора элонгации летальна, поэтому мы не смогли ее осуществить. Была проведена делеция гена TMA19, кодирующего митохондриальный белок с неизвестной функцией, в штамме-делетанте по AIM23. Полученный двойной делетант характеризовался таким же ростом на среде с глицерином, как и делетант по AIM23. Таким образом, при помощи полногеномного секвенирования РНК нам не удалось найти белки, которые могли бы принимать на себя функцию Aim23p в его отсутствие. Были исследованы физиологические эффекты делеции гена AIM23. Оценка частоты возникновения фенотипа «petite» у клеток штамма-делетанта показала, что эта частота возрастает примерно в 4 раза по сравнению с диким типом, но в любом случае не может объяснить наблюдаемые дефекты митохондриальной функции. Также было показано, что делеция гена AIM23 не связана ни с включением ретроградного ответа, ни с изменением репликативной продолжительности жизни клеток штамма-делетанта.