| 1 |
1 января 2009 г.-31 декабря 2011 г. |
Изучение клеточных механизмов образования и разрушения тубуловезикулярных псевдоподий (цитонем) нейтрофилов человека |
| Результаты этапа: В 2009была закончена и опубликована работа по изучению влияния окиси азота (NO) на взаимодействие нейтрофилов человека с бактериями Salmonella enterica (серовар typhimurium) вирулентной линии С53. Мы продемонстрировали, что, индуцируя образование тубуловезикулярных псевдоподий (ТВП), NO сдвигает результат взаимодействия нейтрофилов с бактериями от фагоцитоза в сторону экстраклеточного связывания бактерий при помощи ТВП. Блокирование синтеза NO в нейтрофилах при помощи L-NAME стимулировало фагоцитоз (интернализацию) бактерий нейтрофилами. Мы также обнаружили, что другим природным агентом, способным индуцировать образование длинных тубулярных псевдоподий на поверхности нейтрофилов, является антибиотик стауроспорин, вырабатываемый в природе почвенными бактериями Streptomyces staurosporeus. Стауроспорин известен способностью подавлять фагоцитоцитоз, но при этом не только не снижать, но стимулировать связывание объектов фагоцитоза с нейтрофилами. Мы продемонстрировали, что стауроспорин индуцирует образование на поверхности нейтрофилов ТВП, соединяющих нейтрофилы между собой и способных связывать и агрегировать бактерии S. typhimurium. Мы считаем, что связывание бактерий ТВП, т.е. выступающими из клетки экзоцитозными структурами, является новым, альтернативным фагоцитозу, механизмом взаимодействия нейтрофилов с бактериями и имеет ряд преимуществ перед фагоцитозом. ТВП многократно увеличивают пространство, в котором бактерии доступны нейтрофилам. Снижая число бактерий, проникающих в клетки в результате фагоцитоза, NO препятствует выживанию и размножению бактерий внутри фагоцитов, что по современным представлениям является причиной возникновения хронических инфекций. ТВП предосталяют нейтрофилам возможность транспортировать бактерицидные агенты к связанным и агрегированным бактериям без разбавления в окружающей среде и не повреждая окружающие ткани. Мы предполагаем, что способность сдвигать взаимодействие нейтрофилов с патогенными бактериями в сторону экстраклеточного связывания при помощи ТВП лежит в основе защитного действия NO и стауроспорина при бактериальных инфекциях.
|
| 2 |
1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. |
Изучение клеточных механизмов образования и разрушения тубуловезикулярных псевдоподий (цитонем) нейтрофилов человека |
| Результаты этапа: На предыдущем этапе проекта мы продемонстрировали, что нейтрофилы человека могут устанавливать дистанционные взаимодействия с другими клетками или улавливать бактерии при помощи очень длинных и тонких (150-240 нм в диаметре) мембранных тубуловезикулярных псевдоподий, или цитонем. В 2010 году мы продемонстрировали, что такой механизм контактных взаимодействий присущ и бактериям. Используя сканирующую электронную микроскопию мы измерили диаметр тубулярных отростков бактерий Salmonella Typhimurium, которые прикрепляют бактерии к субстратам, связывают бактерии между собой в биопленках, выращенных на желчных камнях человека или покровных стеклах, а также прикрепляют бактерии к нейтрофилам человека. Диаметр тубулярных отростков бактерий вирулентной линии С53 колебался в пределах 60-70 нм, что в три-четыре раза превышает диаметр флагелл (жгутиков) и в десять раз превышает диаметр пилей. Лишенные флагелл бактерии мутантной линии SJW 880 также были связаны тубулярными структурами 60-90 нм в диаметре. Обследование тонких срезов биофильмов бактерий обеих линий при помощи трансмиссионной электронной микроскопии выявило множественные везикулярные и тубулярные мембранные структуры между бактериями. Диаметр этих мембранных образований совпадал с диаметром тубулярных отростков, определенным при помощи сканирующей электронной микроскопии. Таким образом в настоящей работе мы продемонстрировали, что бактерии способны контактировать с другими бактериями и клетками эукариот на расстоянии при помощи мембранных трубочек. Эти мембранные трубочки возможно являются "мембранных ножнами" бактериальных флагелл или пилей и демонстрируют сходство в строении и функциях с цитонемами нейтрофилов.
Ранее нами было показано, что физиологическим агентом, ответственным за появление ТВП на поверхности нейтрофилов, является окись азота (NO) - основной регулятор адгезии нейтрофилов к стенкам кровеносных сосудов. В крови нейтрофилы находятся в присутствии белков сыворотки крови, включая сывороточнй альбумин. В 2010 году мы изучили влияние сывороточного альбумина на адгезионные взаимодействия нейтрофилов в присутствии окиси азота. Наши результаты показали, что сывороточный альбумин снижает адгезию нейтрофилов к субстрату, стимулируя в то же время межклетчную адгезию или агрегацию нейтрофилов. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что межклеточная адгезия в этом случае осуществляется при помощи цитонем. Эти результаты демонстрируют, что в кровяном русле сывороточный альбумин, наряду с окисью азота, вовлечен в регуляцию адгезионных взаимодействий нейтрофилов с клетками крови и стенками сосудов через образование и функционирование цитонем.
Изучение механизмов адгезионных взаимодействий нейтрофилов с клетками и бактериями может способствовать выработке статегии лечения бактериальных инфекций и патологий, связанных с разрушительной адгезией нейтрофилов к стенкам сосудов при диабете и других нарушениях метаболизма.
|
| 3 |
1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. |
Изучение клеточных механизмов образования и разрушения тубуловезикулярных псевдоподий (цитонем) нейтрофилов человека |
| Результаты этапа: Аннотация
Проект посвящен изучению нового механизма взаимодействия нейтрофилов человека с клетками, субстратами и бактериями, опосредованного очень длинными и тонкими мембранными тубуловезикулярными псевдоподиями (ТВП) или цитонемами. В 2009-2010 годах нами было показано, что нейтрофилы человека способны улавливать бактерии на значительном удалении от тела нейтрофилов при помощи ТВП. Связывание бактерий цитонемами не приводило к фагоцитозу бактерий, но сопровождалось слущиванием цитонем вместе со связанными бактериями с тела нейтрофилов и последующим разрушением цитонем в результате набухания и лизиса. В 2011 году протеомный анализ произведенный при помощи масс-спектрометрии, хроматографии высокого разрешения и соответствующих биохимических методов, показал, что ТВП содержат бактерициды нейтрофилов, специфичные для первичных и вторичных гранул. Основываясь на этих данных, мы полагаем, что ТВП представляют собой секреторные структуры нейтрофилов, содержащие упакованные в мембрану предназначенные к экзоцитозу бактерициды. Связывание бактериальных патогенов выступающими из клетки экзоцитозными структурами является новым, альтернативным фагоцитозу (поглощению), механизмом взаимодействия нейтрофилов с патогенами. Уничтожение бактерий при этом может происходить благодаря высвобождению бактерицидов из ТВП вблизи связанных ими патогенов, что имеет ряд преимуществ перед фагоцитозом. ТВП многократно увеличивают пространство, в котором бактерии доступны нейтрофилам, и бактерии не попадают в клетки, где они могут выживать и размножаться, вызывая хроническое течение инфекций.
Мы выявили, что окись азота (NO), физиологический регулятор адгезии лейкоцитов, сдвигает результат взаимодействия нейтрофилов с бактериями (Salmonella Typhimurium) от фагоцитоза в сторону экстраклеточного связывания бактерий при помощи ТВП. Мы также обнаружили, что антибиотик стауроспорин, вырабатываемый в природе почвенными бактериями Streptomyces staurosporeus, индуцирует образование на поверхности нейтрофилов ТВП, соединяющих нейтрофилы между собой и способных связывать бактерии Salmonella Typhimurium. Мы предполагаем, что способность сдвигать взаимодействие нейтрофилов с патогенными бактериями в сторону экстраклеточного связывания при помощи ТВП лежит в основе защитного действия NO и стауроспорина при бактериальных инфекциях.
Мы также показали, что механизм контактных взаимодействий через тубулярные мембранные структуры является общим для клеток эукариот и прокариот. При помощи сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии мы показали, что мембранные трубочки 60-70 нм в диаметре прикрепляют бактерии Salmonella Typhimurium к субстратам, связывают бактерии между собой в биопленках, выращенных на желчных камнях человека или покровных стеклах, а также прикрепляют бактерии к клеткам хозяина (нейтрофилам человека). Диаметр мембранных трубочек в три-четыре раза превышает диаметр флагелл (жгутиков) и в десять раз диаметр пилей. Мембранные трубочки, возможно, являются "мембранных ножнами" бактериальных флагелл или пилей и демонстрируют сходство в строении и функциях с цитонемами нейтрофилов. Изучение нового механизма контактных взаимодействий клеток хозяина и бактерий через мембранные тубулярные структуры, продуцируемые как клетками, так и бактериями, может послужить выработке новой стратегии защиты организма от бактериальных инфекций.
|
