ИСТИНА

Для проведения экспериментов по кристаллизации апо- и холо- форм формиатдегидрогеназы из патогенной бактерии были проведены культивирование рекомбинантно штамма E.coli - продуцента рекомбинантной ФДГ,и очистка целевого белка. Выход составил 61% и получено 400 мг гомогенного фермента. Данного количества было достаточно для проведения экспериментов по кристаллизации. Первичный поиск условия кристаллизации свободного фермента и в присутствии кофактора и ингибитора ФДГ (апо- и холо- формы соответственно) использовали раствор белка с концентрацией 10 мг/мл в буфере 0,1М Tris-HCl, pH 8.0. Скрининг условий кристаллизации свободной формы SauFDH и комплекса с кофактором проводился на роботизированной системе кристаллизации белков Ригаку, с использованием следующих коммерческих наборов реагентов Hampton Research: Index HT, Crystal screen HT, Crystal Screen Сryo HT, Peg Ion, Peg Rx. Всего было проверено 1728 вариантов осаждающих растворов. Были найдены условия (один вариант для апо- и два варианта для холо-), при которых получались кристаллы для обеих форм размером 10 мкм, которые были непригодны для кристаллографических исследований. Дальнейшая оптимизация условий кристаллизации позволила получить для апо- и холо-форм кристаллы размером 200 и 40 мкм соответственно. Эти кристаллы на втором году выполнения будут проекта использованы для сбора данных и решения структур.

Preparative amounts (450 mg) of recombinant formate dehydrogenase we obtained to start crystallization experiments. Preliminary screening ща crystallization condition was done with free enzyme and in complex with cofactor and inhibitor (apo- amd holo- forms respectively). Commercial crystalization kits Hampton Research: Index HT, Crystal screen HT, Crystal Screen Сryo HT, Peg Ion, Peg Rx were used. First crystalls were to small for X-ray analysis. After otimization of crystallization conditions suitable crystals were obtained.

1. Получение целевого рекомбинантного белка SauFDH в количествах, необходимых для структурных исследований. Для этой цели будет использована разработанная ранее коллективом исполнителей система экспрессии в E.coli и методика очистки. 2. Широкий скрининг условий кристаллизации свободной формы SauFDH с использованием роботизированной системы с последующей оптимизацией условий, в которых наблюдается рост кристаллов. Кристаллизация будет проведена методом диффузии в парах (техника «сидячей капли») в части скрининга, и техникой «сидячая капля» в части оптимизации условий кристаллизации. 3. Широкий скрининг условий кристаллизации комплекса SauFDH с кофактором. Для этой цели свободная форма фермента непосредственно перед кристаллизацией будет инкубирована с избытком кофактора и в присутствии NAD+ ингибитор азид-ион. Скрининг и, при необходимости, последующая оптимизация будут проведены аналогично предыдущему пункту.

Клонирован ген и создана система экспрессии и очистки формиатдегидрогеназы патогенных бактерий

Для проведения экспериментов по кристаллизации апо- и холо- форм формиатдегидрогеназы из патогенной бактерии были проведены культивирование рекомбинантно штамма E.coli - продуцента рекомбинантной ФДГ,и очистка целевого белка. Выход составил 61% и получено 400 мг гомогенного фермента. Данного количества было достаточно для проведения экспериментов по кристаллизации. Первичный поиск условия кристаллизации свобдного фермента и в присутствии кофактора и ингибитора ФДГ (апо- и холо- формы соответственно) использовали раствор белка с концентрацией 10 мг/мл в буфере 0,1М Tris-HCl, pH 8.0. Скрининг условий кристаллизации свободной формы SauFDH и комплекса с кофактором проводился на роботизированной системе кристаллизации белков Ригаку, с использованием следующих коммерческих наборов реагентов Hampton Research: Index HT, Crystal screen HT, Crystal Screen Сryo HT, Peg Ion, Peg Rx. Всего было проверено 1728 вариантов осаждающих растворов. Были найдены условия (один вариант для апо- и два варианта для холо-), при которых получались кристаллы для обеих форм размером 10 мкм, которые были непригодны для кристаллографических исследований. Дальнейшая оптимизация условий кристаллизации позволила получить для апо- и холо-форм кристаллы размером 200 и 40 мкм соответственно. Эти кристаллы на втором году выполнения будут проекта использованы для сбора данных и решения структур.