ИСТИНА

ДНК-метилтрансфераза (МТаза) Dnmt3a является важнейшей МТазой млекопитающих. Она устанавливает «рисунок» метилирования CpG-сайтов, нарушение которого катастрофично для клетки и ведет к развитию опухолей. Механизм действия Dnmt3a мало изучен и базируется на данных, полученных для МТазы прокариот М.HhaI. В проекте исследовано постадийно метилированиеCpG-сайтов, проводимое каталитическим доменом МТазы мыши Dnmt3a (Dnmt3a-CD). Использован широкий набор 18- и 30-звенных ДНК-субстратов с внедренными остатками 2-аминопурина (2АР), 2-пиримидинона (Р) и стереоизомерными аддуктами бензо[a]пирена (B[a]P) с остатками dG и dA. 1) Исследовано комплексообразованиеDnmt3a-CD с ДНК. Показано, что две димерные молекулы Dnmt3a-CD связываются кооперативно с 18-звенными ДНК (как и с 30-звенными), формируя каталитически компетентный комплекс E4S. Сродство к 18-мерам по сравнению с 30-мерами уменьшается за счет увеличения константы диссоциации, характеризующей посадку первого димера МТазы. Удаление 6-оксо-группы остатка гуанина в CpG-сайте сказывается на стабильности комплексов Dnmt3-CD с ДНК и приводит к значительному уменьшению эффективности метилирования. По-видимому, именно эта группа остатка гуанина вовлечена в узнавание МТазой Dnmt3-CD CpG-сайта. Рассмотрена проблема непродуктивного связывания субстрата с Dnmt3a-CD и роль нуклеотидного контекста в этом процессе. 2) Изучены конформационные перестройки в переходном фермент-субстратном комплексе с использованием остатка B[a]P как флуоресцентной метки. В комплексах Dnmt3a-CD с B[a]P-ДНК флуоресценция остатка B[a]P разгоралась при его локализации в малой бороздке двойной спирали и при его интеркалировании в двойную спираль непосредственно рядом с цитозином-мишенью и была частично потушена при интеркалировании в стороне от CpG-сайта. Принимая во внимание, что наблюдаемые эффекты обусловлены изменением полярности окружения B[a]P и тушащего действия соседних оснований, сделано предположение о «выпетливании» остатка цитозина-мишени из двойной спирали и движении каталитической петли Dnmt3a-CD в сторону малой бороздки ДНК при образовании фермент-субстратного комплекса. Эти предположения подтвердились при изучении метилирования B[a]P-ДНК и флуоресценции 2АР в комплексах 2АР-ДНК с Dnmt3a-CD. 3) Рассмотрен механизм деметилированияДНК путем ингибирования Dnmt3a-CD за счет образования устойчивых интермедиатов Dnmt3a-CD с Р-ДНК (P заменяет цитозин-мишень). Показано, что наличие протяженного ДНК-лиганда в малой бороздке двойной спирали препятствует протеканию ключевого события в метилировании – образованию ковалентных интермедиатов. Это предполагает, что контакт каталитической петли с CpG-сайтом происходит через малую бороздку ДНК. 4) Получены кинетические характеристики метилирования МТазой Dnmt3a-CD 18-звенных неповрежденных ДНК и B[a]P-ДНК. Определение и сравнение каталитических констант скорости метилирования в условиях избытка фермента и избытка субстрата (kcat,1 и kcat,2 соответственно) показало, что только kcat,2 уменьшается при повреждении ДНК B[a]P. 5) Определена роль белка-активатора Dnmt3L на различных стадиях метилирования. Dnmt3L увеличивает сродство Dnmt3a-CD к субстрату, и этот эффект возрастает при увеличении длины субстрата. Dnmt3L благоприятствует каталитически компетентной закрытой конформации каталитической петли Dnmt3a-CD, причем петля прилегает к ДНК не так плотно, как в случае прокариотических МТаз. Полученная информация является важным шагом в понимании механизма действия Dnmt3a.