![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Споровики (Alveolata: Apicomplexa: Sporozoa) – широко распространенные облигатные паразиты позвоночных животных: например, возбудители малярии, пироплазмозов, криптоспоридиоза, токсоплазмоза, кишечных кокцидиозов, а также грегарины, паразитирующие в различных группах беспозвоночных. Они охватывают существенную часть биоразнообразия одноклеточных и представляют собой ключевую группу для решения фундаментальных проблем и закономерностей макроэволюции, в том числе проблемы установления внутриклеточного симбиоза с фототрофными предшественниками пластид (апикопласт) и формирования различных способов паразитизма (хищничество - эпицеллюлярный паразитизм - интрацеллюлярный паразитизм). Однако, в настоящее время филогенетические построения затруднены неравномерностью изученности споровиков (всесторонне изучены апоморфные представители, имеющие практическую значимость, тогда как плезиоморфные таксоны, паразитирующие в беспозвоночных, изучены слабо). Кроме того, филогенетические деревья Apicomplexa, построенные на основе анализа наиболее распространённого маркера 18S рРНК, имеют разрешение недостаточное для определения порядка отхождения базальных ветвей (таксонов). В результате выполнения данного проекта предполагается решить важную задачу: на основе комплексного сравнительного анализа ультраструктурных признаков и данных молекулярной филогенетики реконструировать общую картину родственных отношений и эволюции основных таксонов Sporozoa и их предполагаемых предков и представить её в виде филогенетической системы. Основное внимание будет уделено исследованию плезиоморфных малоизученных таксонов (Gregarinea, Blastogregarinea, Agamococcidia, Protococcidia), имеющих ключевое значение для построения естественной филогенетической системы Apicomplexa и демонстрирующих различные стратегии паразитизма.
Sporozoans (Alveolata: Apicomplexa: Sporozoa) are widespread obligate parasites of vertebrate animals (e.g., causing agents of malaria, piroplasmoses, cryptosporidiosis, toxoplasmosis, intestinal coccidioses) and also gregarines parasitizing in various groups of invertebrates. They cover a significant part of the biodiversity of the protists and represent a key group for solving fundamental problems and patterns of macroevolution, including the problems of the origin of the endosymbiosis with phototrophic plastid ancestors (apicoplast) and the formation of various kinds of parasitism (predation - epicellular parasitism - intracellular parasitism). However, phylogenetic constructions are hampered recently by the unevenness of the study of sporozoans (apomorphous representatives of practical importance have been studied well, whereas plesiomorphic taxa parasitizing invertebrates have been poorly studied). In addition, the phylogenetic trees of Apicomplexa, based on the analyses of the most popular marker 18S rRNA, have insufficient resolution to determine the deep branching order. As a result of this project, a general picture of the relations and evolution within the Sporozoa should be reconstructed on the basis of reconciling ultrastructural and molecular evidence. The main attention will be paid to the examination of the plesiomorphic poorly studied taxa as Gregarinea, Blastogregarinea, Agamococcidia, Protococcidia, which exhibit various strategies of parasitism and are the keystones for constructing the natural phylogenetic system of Apicomplexa.
На этапе работ 2018 г. планируется установить филогенетическое положение морфологически обособленных паразитов морских беспозвоночных Coelotropha durchoni и Eleutheroschizon duboscqui (Protococcidia), 3-х видов Rhytidocystis spp. (Agamococcidia) и 2-х видов Siedleckia spp. (Blastogregarinea). Это позволит вплотную подойти к решению вопроса о первичности или вторичности эпицеллюлярного и внутриклеточного способов паразитизма для Apicomplexa в целом, а также решить вопрос о первичности или вторичности признаков морфологии и жизненных циклов агамо- и протококцидий по отношению к основной массе кокцидий - эймериидным и аделеидным кокцидиям. Это, в свою очередь, позволит установить ход эволюции паразитизма от паразитов морских хозяев к паразитам наземных хозяев. Для решения указанной задачи планируется получить нуклеотидные последовательности генов рибосомных РНК и провести филогенетический анализ вышеуказанных организмов (ультраструктура Coelotropha и Eleutheroschizon опубликована, а ультраструктура бластогрегарин изучена нами, но не опубликована в ожидании молекулярно-филогенетических данных; для протококцидии и агамококцидий получены последовательности 18S и 28S рРНК). Помимо этого ожидается выяснение филогенетического положения необычного грегариноподобного организма Digyalum oweni (Apicomplexa incertae sedis) из кишечника гастроподы Littorina obtusata.
Собран материал для молекулярно-филогенетических исследований протококцидии Coelotropha durchoni и получены последовательности 18S и 28S рРНК. Собран материал для молекулярно-филогенетических исследований 3-х видов агамококцидий Rhytidocystis spp. и получены последовательности 18S и 28S рРНК. Прочитаны нуклеотидные последовательности гена 18S рРНК двух видов архигрегарин из залива Восток Японского моря (хозяева - полихеты Stylaroides plumosus и Polydora glycimerica) и, впервые для этой группы споровиков, последовательность рибосомного оперона архигрегарины Selenidium sp. из кишечника полихеты Pygospio elegans с Беломорской биостанции МГУ. Молекулярные данные показывают, что беломорский и один из дальневосточных образцов относятся к одному виду, а также, что все эти виды объединяются вместе с тремя другими и образуют относительно длинную ветвь внутри достаточно разнородной группы архигрегарин. Но требуются дополнительные ультраструктурные исследования. Собран и обработан материал для молекулярно-филогенетического исследования грегариноподобного организма (Apicomplexa incertae sedis) Digyalum oweni из кишечника Littorina obtusata (выделена ДНК). Изучена ультраструктура, а также собран и обработан материал для молекулярно-филогенетических исследований бластогрегарин.
Кафедра зоологии беспозвоночных | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. | Разработка синтетической филогенетической системы споровиков (Apicomplexa: Sporozoa) на основе ультраструктурных и молекулярно-филогенетических данных |
Результаты этапа: Завершены электронно-микроскопические и молекулярно-филогенетические исследования (на основе нуклеотидных последовательностей генов 18S, 5,8S и 28S рРНК) архигрегарины Selenidium pygospionis sp. n. Архигрегарины являются ключевой группой для понимания ранней эволюции Apicomplexa. Изученный нами вид демонстрирует типичные черты архигрегарин: характерное строение покровов (трехмембранная пелликула, подостланная продольными субпелликулярными микротрубочками, располагающимися в виде одного или более слоев) и наличие мукрона (плезиоморфного прикрепительного аппарата) содержащего хорошо развитый апикальный комплекс огранелл (коноид, роптрии, микронемы, мукрональная вакуоль с широким протоком, открывающимся наружу), при помощи которого осуществляется питание путём мизоцитоза (сосания). Кроме того, у S. pygospionis был обнаружен осевой ряд вакуолей, предположительно относящихся к системе распределения питательных веществ. Внутриклеточные стадии S. pygospionis, найденные в эпителии кишечника хозяина, могут указывать на изначальную внутриклеточную локализацию в ходе развития паразита. Последовательности гена 18S рРНК архигрегарин формируют четыре основные филогенетические линии, соответствующие таксономической принадлежности их хозяев, но не морфологическим или биологическим особенностям, использованным для таксономической ревизии Левайном (1971). Следовательно, род Selenidioides Levine, 1971 должен быть отменен. Порядок ответвления филогенетических линий архигрегарин не был разрешен; топологические тесты не отвергли ни парафилию, ни монофилию архигрегарин. Мы также построили филогенетические деревья на основе гена 28S рРНК и почти полного рибосомального оперона (конкатенированные гены 18S, 5,8S и 28S рРНК) S. pygospionis. Будучи в общем предварительными, они, тем не менее, выявили монофилию грегарин, ранее оспаривавшуюся многими молекулярно-филогенетическими исследованиями. Несмотря на свою молекулярно-филогенетическую гетерогенность, архигрегарины выказывают чрезвычайно консервативную плезиоморфную организацию; их отличительные ультраструктурные особенности, по-видимому, являются симплезиоморфиями, а не синапоморфиями. Результаты исследований опубликованы (см. Формы 509). Проведены светооптические, электронно-микроскопические (СЭМ и ТЭМ) и молекулярно-филогенетические исследования (на основе нуклеотидных последовательностей генов 18S, 5,8S и 28S рРНК) двух видов бластогрегарин: Siedleckia nematoides из полихеты Scoloplos armiger и Chattonaria mesnili из полихеты Orbinia latreilli. Бластогрегарины - малоизученные паразиты полихет, с виду похожие на грегарин, но не имеющие стадий сизигия и гаметоцисты в жизненном цикле. Кроме того, перманентная многоядерность и гаметогенез посредством почкования значительно отличают их и от других паразитических Apicomplexa, таких как кокцидии и гематозои. Систематическая принадлежность бластогрегарин долгое время была неясной: разные авторы считали их либо сильно модифицированными грегаринами, либо промежуточной линией между грегаринами и кокцидиями, либо вовсе отдельной самостоятельной группой эукариот. Наши данные являются первыми сведениями по этой группе, полученныыми с помощью современных методов исследования. Морфологический анализ показывает, что бластогрегарины обладают как грегаринными, так и кокцидийными чертами. Некоторые из них, общие с архигрегаринами, скорее всего, представляют собой симплезиоморфии, т.е. анцестральные состояния соответствующих клеточных структур Sporozoa: характерное строение покровов и наличие мукрона, у S. nematoides содержащего все главные компоненты апикального комплекса органелл, а у Ch. mesnili лишённого коноида и роптрий. В отличие от грегарин, но подобно кокцидям, ядра мужских гамет бластогрегарин ассоциированы с двумя кинетосомами (у грегарин с одной). Молекулярно-филогенетический анализ показывает, что бластогрегарины являются самостоятельной рано ответвляющейся линией споровиков. В целом, морфологические и молекулярные данные согласованно предполагают, что бластогрегарины не являются настоящими грегаринами, а представляют собой самостоятельный класс Apicomplexa. Результаты исследований опубликованы (см. Формы 509). Получены почти полные последовательности рибосомальных оперонов (гены 18S, 5,8S и 28S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2) протококцидии Eleutheroschizon duboscqui из кишечника полихеты Scoloplos armiger и агамококцидии Rhytidocystis sp. из кишечника полихеты Ophelia limacina с Беломорской биостанции МГУ. Проведён филогенетический анализ и установлено филогенетическое положение этих организмов, а также протококцидии Coelotropha durchoni, причем новые данные существенно изменили картину филогении Apicomplexa (Sporozoa). Протококцидии и эймериидные эукокцидии оказались полифилетичны: E. dubosqui группируется с эукокцидиями (Eimeriida + Adeleida), тогда как C. durchoni и агамококцидии Rhytidocystis spp. группируются с некоторыми эймериидными эукокцидиями (Margolisiella и Aggregata), формируя кладу MRAC (Margolisiella, Rhytidocystis, Aggregata, Coelotropha). Таким образом, типы жизненных циклов и способы паразитизма оказались распределены среди кокцидий мозаично, поэтому для эволюционной интерпретации этих данных требуются дополнительные исследования. Получены последовательности генов рибосомальных РНК и установлено филогенетическое положение необычного грегариноподобного организма Digyalum oweni (Apicomplexa incertae sedis) из кишечника гастроподы Littorina obtusata. Оказалось, что данный организм принадлежит к особой кладе Squirmida, сестринской Apicomplexa, являясь одной из её базальных ветвей. Все описанные представители этой клады имею ярко выраженную способность к метаболии - особому типу клеточной подвижности, когда клетка активно изменяет свою форму без образования выростов. Электронно-микроскопические исследования выполнялись с образцами, фиксированными глутаровым альдегидом и постфиксированными тетраоксидом осмия на какодилатном буфере. Далее образцы обезвоживались в восходящей спиртовой проводке и ацетоне (СЭМ) или изопропаноле (ТЭМ). Образцы для СЭМ высушивались в критической точке, затем монтировались на столики и напылялись золото-палладиевым покрытием. Образцы для ТЭМ заливались в среду Spurr, а полученные блоки порезаны на ультратонкие срезы, которые затем контрастировались уранил-ацетатом и цитратом свинца. Молекулярно-филогенетические исследования включали в себя выделение ДНК, проведение экспериментов по амплификации генов рибосомных РНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведение гель-электрофореза амплифицированных образцов, экстракцию амплифицированной ДНК из геля с последующей очисткой, секвенирование по Сэнгеру. Далее было выполнено построение контигов, множественное выравнивание, филогенетический анализ конкатенированных маркерных генов с использованием программ MrBayes 3.2.6, PhyloBayes 3.3 и RAxML 8.2.10. Для архигрегарин и бластогрегарин проведён анализ альтернативных топологий филогенетических деревьев: определение значимо или незначимо отличающихся топологий согласно approximately unbiased (AU) и другим статистическим тестам с использованием программ CONSEL и TREEFINDER (см. публикации). В рамках проекта проведены филогенетические анализы не только по популярному в филогенетических исследованиях гену 18S рРНК, но и по последовательностям гена 28S рРНК и рибосомального оперона (конкатенированные гены 18S, 5,8S и 28S рРНК), что является и новым и оригинальным подходом, который существенно дополняет, а в некоторых случаях и изменяет, картину филогении как Apicomplexa, так и альвеолят в целом. На сегодняшний день в рамках данного проекта получено 18 новых нуклеотидных последовательностей генов рибосомных РНК: 7 последовательностей гена 18S рРНК (1 вид агамококцидий Rhytidocystis sp., 2 вида протококцидий (Coelotropha durchoni, Eleutheroschizon duboscqui), 2 вида бластогрегарин, 1 вид архигрегарин (Selenidium pygospionis) и Digyalum oweni), 6 последовательностей гена 5.8S рРНК (1 вид агамококцидий Rhytidocystis sp., 1 вид протококцидий (Eleutheroschizon duboscqui), 2 вида бластогрегарин,1 вид архигрегарин (Selenidium pygospionis) и Digyalum oweni) и 6 последовательностей гена 28S рРНК (1 вид агамококцидий Rhytidocystis sp., 1 вид протококцидий (Eleutheroschizon duboscqui), 2 вида бластогрегарин,1 вид архигрегарин (Selenidium pygospionis) и Digyalum oweni). Помимо вышеизложенного, в 2018 г. начато изучение хищного жгутиконосца Colpodella sp. Кольподеллиды являются сестринской группой споровиков, поэтому их изучение может внести существенный вклад в понимание причин и путей возникновения паразитизма у Apicomplexa. В весенне-летний период 2018 г. проведены полевые исследования на Белом море в Республике Карелия, Лоухский район, пос. Приморский (Беломорская биостанция МГУ) и о. Средний (Учебно-научная база "Беломорская" СПбГУ (ранее - Морская биологическая станция СПбГУ)). Их основными задачами являлись: 1. Сбор хозяев, поиск и отбор паразитов (паразитологические вскрытия). 2. Фиксация для электронной микроскопии (глютаровый альдегид - тетраоксид осмия). 3. Фиксация для молекулярно-филогенетических исследований (этанол или RNAlater (сохраняет нуклеиновые кислоты)). Поставленные перед полевыми исследованиями задачи выполнены в полном объёме: произведены паразитологические вскрытия 9 видов потенциальных хозяев (полихеты и немертины), обнаружены 4 вида низших споровиков: 2 архигрегарины (в полихетах Scalibregma inflatum и Travisia forbesii), 2 эугрегарины (в полихете Pygospio elegans и немертине Lineus ruber) и 1 грегариноподобный организм неясной таксономической принадлежности (в полихете Scoloplos armiger). Все найденные объекты были изучены и задокументированы прижизненно в световом микроскопе, зафиксированы для электронной микроскопии, и из них сделаны образцы для последующей экстракции ДНК (отмыты и зафиксированы этанолом либо RNAlater). В ходе выполнения проекта в 2018 г. было опубликовано 2 статьи в журнале WoS. | ||
2 | 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Разработка синтетической филогенетической системы споровиков (Apicomplexa: Sporozoa) на основе ультраструктурных и молекулярно-филогенетических данных |
Результаты этапа: При помощи световой и сканирующей электронной микроскопии изучена морфология 2-х видов архигрегарин Selenidium spp. из кишечника полихет Travisia forbesii и Scalibregma inflatum: она оказалась типичной для представителей данного рода. Прочитана нуклеотидная последовательность гена SSU (18S) рРНК Selenidium sp. из полихеты Scalibregma inflatum и построено филогенетическое дерево, неожиданно показавшее принадлежность данной грегарины к кладе паразитов сипункулид. Получены сравнительные ультраструктурные данные по строению прикрепительного аппарата у трофозоитов и гамонтов 2-х видов асептатных эугрегарин – Polyrhabdina sp. из полихеты Pygospio elegans и Difficilina sp. из немертины Lineus ruber. Несмотря на различия в деталях строения, прикрепительные аппараты исследованных грегарин имеют общие черты организации как друг с другом, так и с прикрепительными приспособлениями типа "эпимерит", а не "мукрон", и такую же судьбу (отсутствуют у зрелых гамонтов) в ходе развития паразита. Это позволяет пересмотреть взгляды на морфологию и эволюцию эугрегарин: "мукрон" у асептатных лекудиноидных грегарин таковым не является, а является сильно упрощенным эпимеритом, и, следовательно, прикрепительное приспособление типа "эпимерит" является синапоморфией всех эугрегарин, а не только их части. Получены данные по поведению, внешней морфологии, ультраструктуре и молекулярной филогении (ген 18S рРНК) хищного жгутиконосца Colpodella sp., представителя Chrompodellida – сестринской группы споровиков. Предположительно, обнаружен половой процесс, ранее не отмеченный в этой группе. Ультраструктура клетки имеет ряд особенностей: отсутствуют микропоры, какие-либо образования, похожие на роптрии, не найдено экструсом, обнаружены многочисленные клептомитохондрии – митохондрии жертвы, свободно лежащие в цитоплазме хищника без видимых признаков деградации. Молекулярно-филогенетический анализ подтвердил принадлежность исследуемого организма к кладе Chrompodellida, однако расположил его в гуще загадочных, неописанных паразитов – последовательностей, полученных из крови людей, заболевших неизвестной разновидностью лихорадки, и из образцов иксодовых клещей. При помощи световой и сканирующей электронной микроскопии изучена морфология грегариноподобного паразитического организма из кишечника полихеты Scoloplos armiger ("симбионт X"), внешне напоминающего архигрегарин рода Selenidium из-за глубоких пелликулярных борозд и выраженной изгибательной моторики, однако, помимо этого, проявляющего сильную и активную метаболию, что напоминает родственников Apicomplexa – Squirmidea. Прочитана нуклеотидная последовательность рибосомального оперона (конкатенированные гены рРНК и межгенные спейсеры: 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S) и построены молекулярно-филогенетические деревья. Оказалось, что, несмотря на внешнее сходство с архигрегаринами, изучаемый объект принадлежит к кладе Chrompodellida. Данный организм, возможно, иллюстрирует путь перехода от организации хищного жгутиконосца (Colpodella) к организации паразитических плезиоморфных Sporozoa (архигрегарины). Завершена совместная работа по изучению транскриптомов основных групп Apicomplexa, для которых отсутствуют крупномасштабные данные о нуклеотидных последовательностях. Подтверждена монофилия грегарин и эугрегарин, а также родство прото- и агамококцидий с эймериидными кокцидиями. Однако анализ неожиданно показал, что некоторые паразиты, выглядящие как споровики, не имеют с ними близкого общего предка, а сходное строение и образ жизни развились независимо в ходе эволюции, по крайней мере, в трех отдельных случаях. Также оказалось, что криптические хлоропласты широко распространены у споровиков и их близких родственников, в том числе в эволюционных линиях, для которых об их существовании ничего не было известно. Данное исследование проливает новый свет на важную роль хлоропластов в эволюции жизни и может помочь в разработке новых методов лечения заболеваний, вызываемых споровиками. Сбор нового материала успешно проведён в ходе полевых исследований 2019 г. В 2019 г. опубликовано 2 статьи в журналах WoS/Scopus | ||
3 | 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Разработка синтетической филогенетической системы споровиков (Apicomplexa: Sporozoa) на основе ультраструктурных и молекулярно-филогенетических данных |
Результаты этапа: За время выполнения проекта получены данные по тонкому строению и нуклеотидным последовательностям генов рибосомальных рРНК (18S, 5.8S и 28S) 13-ти организмов, принадлежащих к таксонам Squirmidea, Chrompodellida, Blastogregarinea, Archigregarinida, Eugregarinida, Agamococcidia и Protococcidia (степень изученности конкретных объектов охарактеризована ниже и в сводной Таблице 1 – см. файл "Дополнительные материалы"). Получена нуклеотидная последовательность оперона рибосомных РНК (конкатенированные гены и межгенные транскрибируемы спейсеры 18S + ITS1 + 5,8S + ITS2 + 28S рНК) и установлено филогенетическое положение необычного грегариноподобного организма Digyalum oweni (Apicomplexa incertae sedis) из кишечника улитки Littorina obtusata. Выяснилось, что данный организм принадлежит к недавно установленной кладе Squirmidea, сестринской Apicomplexa, являясь одной из её базальных ветвей (рис. 3 – см. файл "Дополнительные материалы"). Все описанные представители этой клады имею ярко выраженную способность к метаболии. Прочитана нуклеотидная последовательность оперона рибосомных РНК ранее обнаруженного нами грегариноподобного паразитического организма из кишечника полихеты Scolplos armiger, внешне напоминающего архигрегарин рода Selenidium из-за глубоких пелликулярных борозд и выраженной изгибательной моторики, однако помимо этого проявляющего сильную и активную метаболию, что напоминает родственников Apicomplexa – Squirmidea, в частности, Digyalum oweni (см. выше). Молекулярно-филогенетический анализ неожиданно показал принадлежность данного организма к кладе Chrompodellea (Chromerida + Colpodellida) – сестринской группы споровиков, причём его положение оказалось сестринским по отношению к фотосинтетику Chromera velia (Рис. 3 и 4). Данный организм иллюстрирует возможный путь эволюционного перехода от жгутиконосцев к паразитическим плезиоморфным Sporozoa. Получены данные по поведению, внешней морфологии, ультраструктуре и молекулярной филогении хищного жгутиконосца Colpodella sp., также представителя Chrompodellea, обнаруженного в пробах придонной воды из Карского моря и выведенного в лабораторную культуру. В качестве пищи (жертвы) использованы бактериотрофные жгутиконосцы Procryptobia sorokini, развивающиеся на чистой культуре бактерии Pseudomonas fluorescens. В случае дефицита пищи две голодающих клетки хищника способны сливаться и образовывать цисту, способную к длительному покою. Наблюдаемое слияние клеток, возможно, представляет собой половой процесс, ранее не отмеченный у кольподеллид. Ультраструктура клетки с одной стороны похожа на таковую других изученных кольподеллид, но с другой стороны имеет особенности: микропоры в пелликуле не обнаружены, субпелликулярные микротрубочки закручены в пологую спираль, в соответствии с формой клетки, что напоминает архитектуру инфекционных зоитов кокцидий и гемоспоридий. При этом отсутствуют компоненты апикального комплекса (роптрии, микронемы, полярное кольцо), за исключением незамкнутого коноида из 23-25 микротрубочек. Также не найдено экструсом. Обнаружены клептомитохондрии – митохондрии жертвы, свободно (без вакуолей) лежащие в цитоплазме хищника без видимых следов деградации. Они отличаютсяя от митохондрий хищника круглой формой и дискоидальными (а не трубчатыми) кристами. Прочитана нуклеотидная последовательность рибосомного оперона. Филогенетический анализ подтвердил принадлежность исследуемого организма к кладе Chrompodellida (Рис. 3 и 4), однако расположил его в гуще загадочных неописанных паразитов – последовательностей, полученных из крови людей, заболевших неизвестной разновидностью лихорадки и из образцов иксодовых клещей (всё с дальневосточной части Китая). Впервые получены данные по ультраструктуре и прочитаны нуклеотидные последовательности рибосомального оперона 2-х видов плезиоморфного таксона Apicomplexa – бластогрегарин. Бластогрегарины - малоизученные паразиты полихет, внешне похожие на грегарин, но не имеющие стадий сизигия и гаметоцисты в жизненном цикле. Кроме того, перманентная многоядерность и гаметогенез посредством почкования значительно отличают их и от других паразитических Apicomplexa, таких как кокцидии и гематозои. Систематическая принадлежность бластогрегарин долгое время была неясной: разные авторы считали их либо сильно модифицированными грегаринами, либо промежуточной линией между грегаринами и кокцидиями, либо вовсе отдельной самостоятельной группой эукариот. Нами впервые показано, что бластогрегарины обладают морфологией, сходной с архигрегаринами: строение покровов, представленных трёхмембранной пелликулой с находящимися под ней продольными субпелликулярными микротрубочками, организованными в один или более слоёв, и осуществляющий функцию мизоцитоза апикальный комплекс, состоящий из коноида, роптрий, полярного кольца (ЦОМТ субпелликулярных микротрубочек) и мукрональной вакуоли. Такое строение характерно для одного из двух изученных видов (Siedleckia cf. nematoides), тогда как у другого (Chattonaria mesnili) полностью редуцирован мукрональный комплекс. При этом, в отличие от грегарин, но подобно кокцидиям, ядра мужских гамет бластогрегарин ассоциированы с двумя кинетосомами, а не с одной как у грегарин. В целом, морфологические и молекулярные данные согласованно предполагают, что бластогрегарины представляют собой плезиоморфных представителей Apicomplexa. С другой стороны, все эти данные не могут указать точное положение бластогрегарин в системе Apicomplexa: с одной стороны, бластогрегарины сочетают в себе морфологические черты как грегарин (ультраструктура), так и кокцидий (вегетативные деления ядер, предшествующие прогамным митозам, отсутствие сизигия и гаметоцисты, двухжгутиковые гаметы); с другой стороны, молекулярно-филогенетический анализ помещает их либо среди архигрегарин (некоторые деревья по 18S рРНК), либо как базальную ветвь грегарин, кокцидий, либо всех споровиков (рибосомальный оперон), причём поддержки положений низкие и тестирование (например, AU тест) не исключает любое из них. Мультигенный анализ по генам белков также группирует бластогрегарин вместе с архигрегаринами, но таксономическая выборка в этих исследованиях пока что недостаточно представительная. Прочитаны нуклеотидные последовательности оперона рибосомных РНК (конкатенированные гены и межгенные транскрибируемы спейсеры 18S + ITS1 + 5,8S + ITS2 + 28S рНК) 3-х видов архигрегарин Selenidium из кишечника полихет Pygospio elegans, Ophelia limacina и Scalibregma inflatum. Молекулярно филогенетический анализ отнёс паразитов P. elegans и O. limacina к той же кладе, что и типовой вид архигрегарин S. pendula. Однако паразит S. inflatum оказался принадлежащим не к кладе паразитов полихет, а в кладе архигрегарин - паразитов сипункулид. Таким образом, подтверждается недавно выявленная ситуация, что, несмотря на консервативную плезиомрфную организацию, архигрегарины, тем не менее, являются не менее разнородными в филогенетическом плане, чем эугрегарины. Получены сравнительные ультраструктурные данные по строению прикрепительного аппарата у трофозоитов и гамонтов 2-х видов асептатных эугрегарин: Polyrhabdina pygosionis из полихеты Pygospio elegans и Difficilina sp. из немертины Lineus ruber. Прикрепительная органелла P. pygosionis устроена значительно сложнее, чем прикрепительный аппарат асептатных эугрегарин рода Lecudina (см. прикреплённый к соответствующей публикации файл) , и скорее напоминает эпимерит септатных грегарин, а также асептатных грегарин Ancora sagittata, исследованных нами ранее (Simdyanov et al., 2017). Ультраструктура прикрепительного приспособления Difficilina sp. сходна с таковой грегарин рода Lecudina, необоснованно называемого "мукрон", также как передний конец архигрегарин (Рис. 1 и 2). Несмотря на различия в строении, прикрепительные аппараты исследованных грегарин имеют общие черты друг с другом, а также с прикрепительными приспособлениями типа "эпимерит", а не "мукрон": несут кольцевую борозду в основании, покрыты единственной мембраной и образуют тесный контакт с клеткой хозяина) и такую же судьбу (отсутствуют у зрелых гамонтов). Всё вышесказанное позволяет пересмотреть взгляды на морфологию и эволюцию эугрегарин, а также подтверждает ранее высказанное предположение о том, что "мукрон" у асептатных лекудиноидных грегарин таковым не является, а является сильно упрощенным эпимеритом, и, следовательно, прикрепительное приспособление типа "эпимерит" является общей особенностью (возможно, синапоморфией) всех эугрегарин, а не только их части (септатных форм). Выяснение структуры и судьбы эпимерита Difficilina является ключевым моментом, так как устраняет последний аргумент сторонников традиционной точки зрения в виде трактовки прикрепительного аппарата лекудиноидных грегарин как мукрона ( в остальных филогенетических линиях эугрегарин – эпимериты). Впервые секвенированы нуклеотидные последовательности рибосомного оперона агомококцидии Rhytidocystis pertsovi и двух видов протококцидий: Eleutheroschizon duboscqi и Coelotropha durchoni, и установлено их филогенетическое положение. Группа протококцидий оказалась полифилетической. Coelotropha durchoni объединяется с Rhytidocystis spp. и кокцидиями Pseudoklossia и Margolisiella (ранее рассматривавшихся как представители отряда Eimeriida) в пределах новой филогенетической линии кокцидиоморфных организмов - Eococcidia, а Eleutheroschizon duboscqi объединился с настоящими кокцидиями (аделеидными и эймериидными) Eucoccida (Рис. 3 и 5). Кроме того, полученные ультраструктурные данные впервые однозначно показали внутриклеточный паразитизм у агамококцидий, а анализ транскриптомных данных, проведённый зарубежными коллегам и коллегами из НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, позволил предположить у них неописанный половой процесс на основе присутствия набора генов, ответственных за мейоз (см. публикацию 2020 г.). Комплексный анализ полученных за весь отчетный период ультраструктурных и молекулярно-филогенетических данных по ключевым группам низших споровиков вместе с литературными данными позволил произвести ревизию макросистемы и предложить проект новой филогенетической системы Apicomplexa. Система, общепринятая в настоящее время, делит Apicomplexa на "безконоидных" (Aconoidasida – гемоспоридии и пироплазмиды) и коноидных (все остальные споровики, т.е. грегарины, криптоспоридии и кокцидии). Это деление не соответствует современным молекулярно-филогенетическим данным, поскольку "Aconoidasida" являются ближайшими родственниками эукокцидий (эймериид и аделеид), а следовательно "Conoidasida" оказывается парафилетической группой (Рис. 6); при этом объёмы таксонов несопоставимы. Однако простое проецирование молекулярно-филогенетических деревьев на область таксономии не может быть использовано для построения новой системы Apicomplexa. Филогении по наиболее популярному для филогенетических целей гену 18S рРНК (обширная база данных по Apicomplexa) хорошо выделяют отдельные филогентические линии (например, эймериидных и аделеидных кокцидий, гемоспоридий, филогенетические линии грегарин (надсемейства)), однако неспособны разрешить "глубинное" ветвление (deep branching) "хребта" (backbone) Apicomplexa из-за разных скоростей эволюции в разных линиях, что выражается в длине ветвей – от коротких до экстремально длинных. Алгоритмы филогенетического анализа пока что не научились преодолевать это препятствие с хорошим результатом, что выражается в низких поддержках и высокой чувствительности к качеству данных: размеру выборки и длине выравнивания. Определённые надежды вселяют результаты анализа конкатенированных генов рибосомных РНК, а также мультигенный анализ по белкам (данные из геномного и транскриптомного анализов), однако таксономические выборки пока что недостаточно представительны и вряд ли станут такими в ближайшее время из-зи трудоёмкости и дороговизны этих работ, несмотря на имеющийся очевидный прогресс в этой области. Поэтому в тех случаях, когда молекулярные данные не могут быть однозначно интерпретированы, были привлечены признаки морфологии и биологии, что, в частности, позволило предложить кандидатные синапоморфии для эугрегарин - самой большой группы грегарин, монофилия которой пока что не может быть с уверенность выявлена молекулярно-филогенетическими методами. По результатам такого комплексного анализа были проведены следующие действия: (1) Включение Chrompodellea в тип Apicomplexa в качестве подтипа, наряду с подтипом Sporozoa (это название в настоящее время практически не используется, хотя Apicomplexa - это младший синоним и именно он не должен бы употребляться; включение хромподеллид позоляет сохранить его и наполнить новым таксономическим смыслом). (2) Отказ от деления Sporozoa на Conoidasida и Aconoidasida, а вместо этого деление на надклассы Gregarinomorpha и Coccidiomorpha, а также, в дополнение к этому, класс Blastogregarinea неясного положения (см. выше). (3) Рассмотрение грегарин как монофилетической группы (без криптоспоридий) и выделение двух классов в составе Gregarinomorpha: Gregarinea и Cryptosporidia (по результатам молекулярно-филогенетического анализа). Кандидатная синапоморфия грегарин – гаметоциста (инцистированный сизигий), отсутствующая у остальных споровиков. (4) рассмотрение Eugregarinida как монофилетической группы и включение Neogregarinida в их состав (по результатам молекулярной филогении; их близкое родство с актиноцефалидными эугрегаринами также ранее предполагалось Grassé на основе особенностей ооцист и теперь полностью подтвердилось). Кандидатные синапоморфии эугрегарин – эпимерит (см. выше) и особое строение эпицитарных гребней, полностью коррелирующее со способностью к скользящему движению. (5) выделение трёх классов в составе Coccidiomorpha: Eococcidia, Eucoccidia и Haematozoa. Класс Eocoсcidia является новым, создан по данным молекулярной филогении, и включает четыре отряда, два из которых - новые. В состав Eucoccidia по данным молекулярной филогении, помимо традиционных отрядов Eimeriida и Adeleida, включены два новых: Eleutheroschizonida и Haemohormidiida. Также была произведена коррекция названий в пользу старших синонимов и/или в пользу их смыслового наполнения. Например, Aconoidasida (исходно Aconoidea) было заменено на Haematozoa, поскольку у оокинет Plasmodium gallinaceum, а возможно и других представителей, есть коноид; с другой стороны все представители этого таксона – кровепаразиты. Ниже представлена общая структура новой системы до отрядов Sporozoa, а общие характеристики таксонов и конкретные пояснения даны в файле "Дополнительные материалы". Сопоставление новой и общепринятой систем представлено там же на Рис. 6. Представленная система представляет собой именно проект, поскольку изученность Apicomplexa неравномерна (несовпадение охватов морфологическими и молекулярно филогенетическими методами) и далека от полной, поэтому в дальнейшем ожидаются дополнения и корректировки – возможно, достаточно существенные. Проект филогенетической системы Apicomplexa Тип Apicomplexa Levine, 1970 stat. nov. Подтип Chrompodellea Janouškovec et al., 2015 Подтип Sporozoa Leuckart, 1879 Класс Blastogregarinea Chatton et Villeneuve, 1936 (Sporozoa incertae sedis). Отряд Siedleckiida Simdyanov et al., 2018 Надкласс Gregarinomorpha nov. (non sensu Gregarinomorpha Grassé, 1953). Класс Gregarinea Dufour, 1828 Отряд Archigregarinida Grassé, 1953 Отряд Eugregarinida Léger, 1900 Класс Cryptosporidia Класс Cryptosporidia (Cavalier-Smith, 2014), emend. Отряд Cryptosporidiida (Léger, 1911) emend. Надкласс Coccidiomorpha (Doflein, 1901) nov. Класс Eococcidia Miroliubova et al., 2020, emend. Отряд Pseudoklossiida Miroliubova et al., 2020. Отряд Agamococcidiida Levine 1979, emend. Miroliubova et al., 2020. Отряд Coelotrophida (Vivier, 1981), emend. Отряд Aggregatida (Labbé, 1899) ordo nov. Класс Eucoccidia (Syn. Coccidia Leuckart, 1869; Coccidiasina Levine, 1985, pro parte) emend. Отряд Eleutheroschizontida (Chatton and Villeneuve, 1936) ordo nov. Отряд Haemohormidiida ordo nov. Отряд Adeleida Léger, 1911 Отряд Eimeriida Léger, 1911 Класс Haematozoa (Viver, 1982) emend. Отряд Nephromycetida (Cavalier-Smith, 2014) emend. Отряд Haemosporida Danilewsky, 1885. Отряд Piroplasmida Wenyon, 1926 В ходе выполнения проекта всего было опубликовано 5 статей в журналах Q1 и Q2 по версии Web of Science: Miroliubova, T. S., Simdyanov, T. G., Mikhailov, K. V., Aleoshin, V. V., Janouškovec, J., Belova, P. A., Paskerova, G.G. Polyphyletic origin, intracellular invasion, and meiotic genes in the putatively asexual agamococcidians (Apicomplexa incertae sedis). // Scientific reports. 2020. Vol. 10. P. e72287. Janouškovec J., Paskerova G. G., Miroliubova T. S., Mikhailov K. V., Birley T., Aleoshin V. V., Simdyanov T. G. Apicomplexan-like parasites are polyphyletic and widely but selectively dependent on cryptic plastid organelles. // eLife. 2019. Т. 8. С. e49662. Kováčiková M., Paskerova G. G., Diakin A., Simdyanov T. G., Vaškovicová N., Valigurová A. Motility and cytoskeletal organisation in the archigregarine Selenidium pygospionis (Apicomplexa): observations on native and experimentally affected parasites. // Parasitology Research. 2019. Т. 118. С. 2651-2667. Paskerova G. G., Miroliubova T. S., Diakin A., Kováčiková M., Valigurová A., Guillou L., Aleoshin V. V., Simdyanov T. G. Fine structure and molecular phylogenetic position of two marine gregarines, Selenidium pygospionis sp. n. and S. pherusae sp. n., with notes on the phylogeny of Archigregarinida (Apicomplexa). // Protist. 2018. Vol. 169. P. 826-852. Simdyanov T. G., Paskerova G. G., Valigurová A., Diakin A., Kováčiková M., Schrével J., Guillou L., Dobrovolskij A. A., Aleoshin V. V. First utrastructural and molecular phylogenetic evidence from the blastogregarines, an early branching lineage of plesiomorphic Apicomplexa. // Protist. 2018. Vol. 169. P. 697-726. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".