ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Хроническая инфекция вирусом гепатита В (HBV) является одной из основных причин развития гепатоцеллюлярной карциномы. Механизмы HBV-зависимого канцерогенеза разнообразны и изучены недостаточно. Заражение HBV сопровождается окислительным стрессом, который вносит существенный вклад в опухолевую прогрессию. Ключевую роль, как в индукции окислительного стресса, так и в канцерогенезе играет вирусный белок HBx. Целью проекта является проверка гипотезы о том, что НВх индуцирует продукцию активных форм кислорода (АФК) в митохондриях, что ведет к активации сигнальных путей, участвующих в опухолевой прогрессии. В клетках гепатомы HepG2, экспрессирующих белок НВх, а также в клеточных моделях вирусной инфекции, полученных партнерами по проекту, будет исследовано участие митохондрий в развитии окислительного стресса. Наряду с традиционными митохондриальными ингибиторами будут использованы новые митохондриально-направленные соединения, обладающие антиоксидантными свойствами. Планируется проанализировать изменения цитоскелета и сигнальные механизмы ведущие к эпителиально-мезенхимальному переходу, который служит основным звеном в образовании метастазирующих опухолей. Предполагается, что митохондриальные АФК стимулируют этот переход в клетках печени. Хроническое воспаление является одним из ключевых условий персистирующей инфекции HBV и способствует развитию опухолей. В рамках проекта будет проанализирована АФК-зависимая активация транскрипционного фактора NFkB, который является основным компонентом воспалительных сигнальных путей. Наряду с активацией факторов транскрипции митохондриальные АФК могут участвовать в HBV-зависимых нарушениях эпигенетической регуляции в клетках печени. Для проверки этого предположения будет исследовано действие митохондриальных ингибиторов и антиоксидантов на уровень метилирования промоторов генов клеточных белков, меняющих свою экспрессию при инфекции HBV. Предполагается, что подходы, направленные на снижение продукции АФК в митохондриях, могут быть использованы для профилактики и терапии рака печени, связанного с инфекцией вирусом гепатита В.
Chronic infection with the hepatitis B virus (HBV) is one of the main causes of hepatocellular carcinoma. The mechanisms of HBV-dependent carcinogenesis are diverse and insufficiently studied. Infection with HBV is accompanied by oxidative stress, which makes a significant contribution to the tumor progression. A key role in both the induction of oxidative stress and in carcinogenesis is played by the virus protein HBx. The aim of the project is to test the hypothesis that HBX induces the production of reactive oxygen species (ROS) in the mitochondria, which leads to activation of the signaling pathways involved in the tumor progression. In the hepatoma HepG2 cells expressing the HBx protein, as well as in the cellular models of the viral infection received by the project partners, the involvement of mitochondria in the development of oxidative stress will be investigated. Along with traditional mitochondrial inhibitors, new mitochondrial-directed compounds possessing antioxidant properties will be used. It is planned to analyze changes in the cytoskeleton and signaling mechanisms leading to the epithelial-mesenchymal transition, which serves as the main link in the formation of metastatic tumors. It is assumed that mitochondrial ROS stimulate this transition in the liver cells. Chronic inflammation is one of the key conditions of persistent HBV infection and promotes the development of tumors. The project will analyze the ROS-dependent activation of the transcription factor NFkB, which is the main component of the inflammatory signaling pathways. Along with the activation of transcription factors, mitochondrial ROS can participate in HBV-dependent disorders of epigenetic regulation in liver cells. To test this assumption, the effect of mitochondrial inhibitors and antioxidants on the level of methylation of promoters of cellular protein genes that change their expression in HBV infection will be investigated. It is assumed that approaches aimed at reducing the production of ROS in mitochondria can be used to prevent and treat liver cancer associated with hepatitis B virus infection.
В клетках гепатомы HepG2, экспрессирующих белок НВх, а также в клеточных моделях вирусной инфекции, полученных партнерами по проекту, будет исследовано участие митохондрий в развитии окислительного стресса. Для этого наряду с традиционными митохондриальными ингибиторами будут использованы новые митохондриально-направленные соединения, обладающие антиоксидантными свойствами. Будет исследована роль митохондриальных АФК в изменениях цитоскелета и активации сигнальных механизмов, ведущих к эпителиально-мезенхимальному переходу, который служит основным звеном в процессе HBV-зависимой опухолевой прогрессии.
Исследования роли митохондрий в окислительном стрессе ведутся в нашей лаборатории с 2005г. Мы показали, что митохондрии могут служить источником АФК (митоАФК) при окислительном стрессе, вызванном экзогенной перекисью водорода (Chernyak et al. 2006), а митоАФК индуцируют фрагментацию митохондрий в клетках (Pletjushkina et al. 2005). В 2008г мы обнаружили, что митоАФК могут участвовать в опухолевом перорождении и росте опухолей. Было показано, что митохондриально-направленные антиоксиданты вызывают морфологическую нормализацию клеток карциномы шейки матки и прямой кишки и торможение роста привитых опухолей у мышей (Агапова и др. 2008). Нами велись исследования перестройки актинового цитоскелета при эпителиально-мезенхимальном переходе(Шагиева и др. 2012) и было обнаружено, что гамма-изоформа актина стимулирует инвазивность раковых клеток, в то время как бета-изоформа снижает онкогенный потенциал (Dugina et al. 2015). В 2016 мы показали, что митоАФК стимулируют эпителиально-мезенхимальный переход и этот эффект связан с активацией киназы ERK1/2 (Shagieva et al. 2017). С 2005 г. мы исследовали участие митохондрий в воспалительном сигналинге. Мы впервые показали,что именно митохондрии служат основным источником АФК при стимуляции TNF. Было установлено, что воспалительная активация эндотелия сосудов при старении мышей зависит от образования АФК в митохондриях(Zinovkin et al. 2014). При изучении действия TNF на клетки эндотелия было обнаружено, что разобщители окислительного фосфорилирования и антиоксиданты подавляют экспрессию молекул адгезии на поверхности клеток (Ромащенко и др. 2015) и предотвращают усиление проницаемости эндотелия для макромолекул (Галкин и др. 2016). Это наблюдение подтвердилось в опытах на мышах,где разобщители и митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращали острую летальность при внутривенном ведении TNF (Zakharova et al. 2017).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 2 ноября 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Роль митохондриального окислительного стресса в регуляции онкогенных процессов, вызванных вирусом гепатита В. |
Результаты этапа: На первом этапе были созданы генетические конструкции для трансфекции белка НВх в клетки гепатомы HepG2. В этих конструкциях ген белка HBx находился под контролем сильного промотора CMV. Получена конструкция для проведения транзиентной трансфекции и лентивирусная конструкция для создания клеточных линий. Для анализа эффективности трансфекции использовали конструкции с флуоресцентным белком EGFP. Для характеристики клеточной модели были исследованы свойства клеток HepG2 на различных подложках. Установлено, что эти клетки имеют эпителиально-подобные характеристики при культивации на пластике, но приобретают выраженные мезенхимальные черты при культивации на подложке покрытой 10% коллагеном. Эти наблюдения соответствуют данным о том, что активация интегринов (рецепторов коллагена) может приводить к эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП). Культивация клеток HepG2 на 10% коллагене в присутствии митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 приводила к обращению ЭМП и формированию эпителиальных островков. С помощью флуоресцентных зондов было проанализировано образование митохондриальных активных форм кислорода (митоАФК) и показано его усиление при культивации на коллагене. SkQ1 эффективно подавлял образование митоАФК. Эти данные указывают на центральную роль митохондриальных АФК в интегрин-зависимом ЭМП, который чрезвычайно важен для гепатоканцерогенеза. Для трансфекции клеток HepG2 были использованы подложки с 1% коллагеном, на которых клетки преимущественно имеют эпителиально-подобные характеристики. Оптимизация условий транзиентной трансфекции позволила получить 50-70% эффективность. С помощью иммуноблоттинга была подтверждена экспрессия белка HBx. Трансфекция привела к изменению морфологии клеток, что указывало на индукцию ЭМП. Культивация трансфецированных клеток в присутствии SkQ1 приводила к обращению ЭМП. Это стало первым указанием в пользу гипотезы о том, что митоАФК играют важную роль в индукции ЭМП под действием вирусного белка НВх. | ||
2 | 1 ноября 2018 г.-30 сентября 2019 г. | Роль митохондриального окислительного стресса в регуляции онкогенных процессов, вызванных вирусом гепатита В. |
Результаты этапа: На втором этапе были продолжены исследования эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в клетках гепатомы HepG2. Детальный анализ актинового цитоскелета показал, что культивирование на 10% коллагене вызывает разборку пучков бета-актина, локализованных на периферии клеток, и не затрагивает сеть гамма-актина. В этих условиях не наблюдалось образование эпителиальных островков, межклеточные Е-кадгерин-содержащие контакты разбирались и клетки приобретали фибробласто-подобную морфологию. В присутствии митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 пучки бета-актина и Е-кадгерин-содержащие межклеточные контакты сохранялись при культивировании на коллагене. Показано, что гуморальные факторы, которые выделяются клетками гепатомы в среду при росте на коллагене, стимулируют ЭМП. Среда, полученная при культивировании клеток на коллагене в присутствии SkQ1 (и не содержащая SkQ1), не вызывала ЭМП. Предположение о том, что культивирование на коллагене ведет к усилению продукции митохондриальных активных форм кислорода (АФК) не подтвердилось. Таким образом, митохондриальная продукция АФК участвует как в передаче сигнала ЭМП от интегриновых рецепторов, так и в выработке гуморальных факторов, вызывающих ЭМП, но повышение уровня АФК не является стимулом к ЭМП в клетках гепатомы. Лентивирусная трансдукция белка HBx в клетки HepG2 вызывала разборку пучков бета-актина и межклеточных Е-кадгерин-содержащих контактов, а также морфологические изменения, которые были сходны с теми, что вызывала культивация на коллагене. Экспрессия HBx вызывала лишь небольшое повышение уровня АФК в цитоплазме клеток. Для анализа окисления митохондриальных липидов под действием HBx мы использовали новый митохондриально-направленный флуоресцентный зонд MitoCLox, разработанный в нашей лаборатории в рамках выполнения данного проекта. Данные, полученные с помощью молекулярно-динамического моделирования и подтвержденные в экспериментах на модельных мембранах свидетельствуют о специфической чувствительности этого зонда к окислению кардиолипина. Лентивирусная трансдукция белка HBx не привела к заметному окислению MitoCLox в клетках HepG2. Ранее мы показали, что фрагментация митохондрий может служить чрезвычайно чувствительным индикатором окисления митохондриальных компонентов. Эффект НВх на структуру митохондрий в клетках HepG2 был исследован, как в случае лентивирусного заражения, так и для транзиентной трансфекции. В последнем случае структуру митохондрий изучали лишь в клетках, где прошла успешная трансфекция и экспрессировался митохондриальный флуоресцентный белок mitoRFP. В обеих моделях структура митохондрий в трансфицированных НВх клетках не отличалась существенно от клеток трансфицированных контрольной плазмидой. Таким образом, НВх вызывает небольшое повышение уровня цитоплазматических АФК не сопряженное с митохондриальным окислительным стрессом. Митохондриальная продукция АФК необходима для индукции ЭМП под действием HBx, но повышение их уровня не является стимулом к ЭМП в этой модели. Для анализа сигнальных путей, которые могли бы активироваться под действием HBx, мы исследовали экспрессию несколько потенциальных генов-мишеней. В частности, исследовали экспрессию генов основных антиоксидантных белков каталазы и супероксиддисмутазы СОД1, а также белков, регулирующих ЭМП: TGF-β1 (трансформирующий ростовой фактор бета-1), N-кадгерин (один из маркеров мезенхимальных клеток), Е-кадгерина. Экспрессия всех этих генов мало менялась в ответ на HBx. Кроме того, была измерена экспрессия гена матриксной металлопротеиназы-9, участвующей в модификации структур внеклеточного матрикса путем деградации коллагенов и других межклеточных белков, гена провоспалительного цитокина –интерлейкина-8 и гена, кодирующего протоонкоген c-myc. Экспрессия этих генов стимулируется при активации NFkB-зависимого сигнального пути и может служить индикатором активации этого пути. Мы показали, что экспрессия этих генов не менялась в ответ на HBx. Таким образом, показано, что HBx, вероятно, не вызывает активации NFkB-зависимого сигнального пути. Вопрос о сигнальных путях, которые модифицируются под действием HBx, остается открытым. | ||
3 | 1 февраля 2020 г.-30 октября 2020 г. | Роль митохондриального окислительного стресса в регуляции онкогенных процессов, вызванных вирусом гепатита В. |
Результаты этапа: 1. Получены новые генетические конструкции и линии клеток гепатомы HepG2, экспрессирующие белок НВх. 2. Показано, что НВх вызывает перестройку актинового цитоскелета и разборку межклеточные Е-кадгерин-содержащих контактов, в результате чего разрушались эпителиальные островки и клетки приобретали фибробласто-подобную морфологию. 3. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 предотвращал перестройку клеток под действием НВх. Можно полагать, что митохондриальная продукция АФК необходима для этих перестроек. 4. Анализ экспрессии транскрипционных факторов Snail и Slug, а также эпителиальных и мезенхимальных маркеров (E- и N-кадгеринов, соответственно) показал, что перестройка клеток HepG2 под действием НВх не требует запуска программы эпителиально-мезенхимального перехода. 5. Исследование сигнальных механизмов, определяющих перестройку клеток HepG2 под действием НВх показало, что HBx, не вызывает активацию NFkB-зависимого сигнального пути, протеотоксического стресса и эпигенетических изменений, способствующих окислительному стрессу в клетках HepG2. 6. Показано, что культивация клеток HepG2 на подложке с коллагеном (что характерно для агрессивных гепатом) приводит к изменениям цитоскелета, а также к разборке Е-кадгерин-содержащих контактов подобно тому, как это наблюдалось под действием HBx. Этот эффект от части определяется гуморальными факторами, которые секретируются клетками HepG2. 7. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 предотвращал выработку гуморальных факторов и перестройку клеток под действием коллагена. 8. Полученные нами данные указывают на возможность применения митохондриально-направленных антиоксидантов для профилактики и терапии рака печени различного (в том числе вирусного) происхождения. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | Forma_503_ron_No17-00-00088.pdf | Forma_503_ron_No17-00-00088.pdf | 116,3 КБ | 6 октября 2018 [Bchernyak] | |
2. | RFBR_No17-00-00088_figures.pdf | RFBR_No17-00-00088_figures.pdf | 1,5 МБ | 6 октября 2018 [Bchernyak] | |
3. | Proekt_kratko.rtf | Proekt_kratko.rtf | 17,4 КБ | 6 октября 2018 [Bchernyak] | |
4. | Nauchno_populyarnyij_otchet_2019.rtf | Nauchno_populyarnyij_otchet_2019.rtf | 26,3 КБ | 3 декабря 2019 [Bchernyak] | |
5. | Risunki2019.pdf | Risunki2019.pdf | 1,1 МБ | 3 декабря 2019 [Bchernyak] |