ИСТИНА

Фундаментальной задачей проекта является исследование распределения заряда на поверхности вирионов вирусов растений со спиральной структурой и его связь с трансляционными свойствами фитовирусов, относящихся к родам Tobamovirus, Potexvirus. В первично инфицированной клетке для развития инфекции необходима трансляция «родительской» вирусной РНК. Для вируса табачной мозаики продемонстрирован феномен так называемой котрансляционной разборки. Ранее мы продемонстрировали, что для потексвирусов характерен другой механизм. Существует два способа трансляционной активации нетранслируемой в составе вириона РНК Х вируса картофеля (ХВК) и вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт): путем фосфорилирования белка оболочки (БО) потексвируса в составе вириона и вследствие взаимодействия вириона с транспортным белком 1 (ТБ1). По нашим предварительным данным существует прямая зависимость между распределением зарядов на поверхности вирусной частицы и ее способности к трансляции геномной РНК в составе вириона. Более того, существует вероятность, что поверхность некоторых вирионов заряжена неравномерно. В процессе выполнения проекта планируется провести картирование зарядов на поверхности нативных вирионов со спиральной симметрией, относящихся к различным таксономическим группам, вирусоподобных частиц, не содержащих в своем составе нуклеиновую кислоту, вирусных рибонуклеопротеидов и вирионов, обработанных РНКазами, с помощью магнитных частиц, обладающих анионообменными свойствами. Будет проведено исследование зависимости между распределением зарядов на поверхности вирусной частицы и ее способности к трансляции геномной РНК в составе вириона. В ходе выполнения проекта будет осуществлено сравнительное изучение распределения зарядов на поверхности трансляционно активных комплексов потексвирусы - ТБ1 (взаимодействие которого с БО инициирует разборку белковой спирали и трансляцию РНК) и фосфорилированных вирионов с вирионами ХВК и ВМАльт. Это позволит получить прямые доказательства изменения структуры белковой спирали при взаимодействии вирионов потексвирусов с ТБ1 и получить новые данные о не имеющем аналогов феномене индукции разборки вириона при взаимодействии с транспортным белком.

The fundamental objective of the project is to study the charge distribution on the surface of plant viruses with a helical structure and its relationship to the translational properties of viruses related to genera Tobamovirus and Potexvirus. The translation of "parental" viral RNA in a primarily infected cell is necessary for the development of infection. The phenomenon of commonly named co-translational disassembly has been demonstrated for tobacco mosaic virus. We have demonstrated, previously, a completely different type of translational activation for Potexvirus genus. There are two types of translational activation of the non-translatable RNA in the virions of Potato virus X (PVX) and Alternanthera mosaic virus (AltMV): by phosphorylation of Potexvirus virions coat protein (CP) and due to the interaction of the virion with movement protein 1 (MP1). According to our preliminary data, there is a direct relation between the virus particle surface charge distribution and its ability to translate genomic RNA. Furthermore, there is a possibility that the surface of some virions is unevenly charged. In the project is planned to map the surface charges of native virions with helical symmetry belonging to different taxonomic groups, virus-like particles without nucleic acid, viral ribonucleoproteins and virions treated with RNAses. The magnetic particles with anion-exchange properties will be used for this purpose. Relation between the distribution of charges on a virus particle surface and its ability to genomic RNA translation will be studied. A comparative study of the charges distribution on the surface of the translationally active potexvirus-MP1 complexes (MP1 interaction with CP initiates disassembly of the protein helix and RNA translation) and phosphorylated virions of PVX and AltMV virions will be conducted. This will provide direct evidence of a protein helix structure changes due the interaction of potexviruses with MP1. Thus the new data on the unique phenomenon of virion disassembly induction in the interaction with the movement protein will be obtained.

Будет проведено картирование зарядов на поверхности нативных вирионов вирусов растений со спиральной симметрией; ВПЧ, не содержащих в своем составе нуклеиновую кислоту; вРНП; вирионов, обработанных РНКазами, и комплексов потексвирусы-транспортный белок 1 (ТБ1) с помощью магнитных частиц, обладающих анионообменными свойствами. Будет исследована зависимость между распределением зарядов на поверхности вирусной частицы и ее способностью к трансляции геномной РНК в составе вириона. Будут получены данные о распределении заряда на поверхности вирионов вирусов растений со спиральной структурой, а также о его связи с трансляционными свойствами фитовирусов. Полученные результаты внесут определенный вклад в фундаментальные знания о строении и функционировании вирусных частицах и механизмах развития вирусной инфекции. В настоящий момент для большинства вирусов нет никаких данных о характере распределения поверхностного заряда и о том, каким образом это влияет на свойства вирусной частицы, в том числе трансляционные. Поскольку вирионы и/или вРНП являются транспортными формами и играют роль при распространении вирусной инфекции по растению, исследование механизмов образования вирусных частиц и их разборки носит фундаментальный характер, а также необходимо для разработки новых методов безвирусного растениеводства. Также исследование физико-химических свойств искусственных вРНП, содержащих БО вирусов растений и генетический материал различной природы, может стать основой при создании новых биотехнологий для медицины и сельского хозяйства.

Коллектив авторов заявки успешно исследовал структуру и свойства ВПЧ и вРНП, полученных на основе вирусов. В ходе выполнения проектов РФФИ 10-04-00089-а и 13-04-00543-а было продемонстрировано, что инициация сборки гетерологичных вРНП (чужеродная РНК с БО) in vitro так же, как и гомологичных, начинается с 5'-конца молекулы РНК и не зависит от специфической нуклеотидной последовательности (Архипенко и др., 2011). Впервые для анализа процесса сборки вРНП был использован метод анализа траекторий наночастиц (nanoparticle tracking analysis – NTA). С помощью NTA впервые удалось количественно оценить эффективность образования вРНП при инкубации БО ХВК с молекулами РНК различной природы. Нами впервые показано, что важным условием сборки спиральных ВПЧ in vitro является предварительное кэпирование нуклеиновой кислоты. При этом кэп-структура сама по себе не является сигналом сборки вРНП, но, вероятно, влияет на 5'-конец молекулы РНК, создавая конформационный сигнал упаковки и способствуя эффективному взаимодействию РНК и белка оболочки (БО) (Petrova et al., 2013, 2015). В нашей лаборатории разработаны оригинальные методы анализа структуры вирионов и ВПЧ, среди них трансляционный и трипсиновый тесты. Сотрудники нашего коллектива активно внедряют метода анализа траекторий наночастиц (NTA) для исследования размеров, концентрации и агрегационного состояния вирусов растений, вирусоподобных частиц и их комплексов с различными белками. Все эти исследования лягут в основу предлагаемого проекта.

На I этапе были получены и охарактеризованы препараты вирусов, относящихся к роду Tobamovirus (вирус табачной мозаики – ВТМ, вирус зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО)); к роду Potexvirus (Х вирус картофеля - ХВК, вирус мозаики альтернантеры - ВМАльт). Для картирования поверхностного заряда вириона использовали положительно заряженные магнитные частицы (МЧ) fluidMAG-DEAE (50 нм, Chemicell, Германия). Продемонстрировано, что суммарный поверхностный отрицательный заряд ВТМ и ВЗМКО сконцентрирован на одном из концов. Ранее мы показали, что, в отличие от РНК ВТМ (а теперь и РНК ВЗМКО, трансляционные свойства которого изучены впервые), инкапсидированная РНК ХВК и ВМАльт, не способна транслироваться in vitro. При инкубации ХВК и ВМАльт с МЧ, они связывались с вирионами не только с торцами, но и частично по всей их поверхности. На II этапе впервые было проведено картирование заряда на поверхности вирусоподобных частиц (ВПЧ) ВТМ и ВМАльт, состоящих только из БО. Показано, что МЧ распределены по поверхности ВПЧ равномерно, и, следовательно, ключевую роль в концентрации суммарного отрицательного заряда на торцах у вирионов играет именно геномная РНК. Впервые показано, что у ВТМ, обработанного РНКазами меняется характер связывания с МЧ в отличие от ХВК и ВМАльт, то есть доступность геномной РНК в составе вириона у тобамо- и потексвирусов разная, что хорошо согласуется с различиями в трансляционных свойствах инкапсидированных РНК этих вирусов in vitro. На III этапе при изучении распределение заряда на поверхности вирусных рибонуклеопротеидов (вРНП), полученных на основе БО ХВК и геномных РНК, относящихся к различным таксономическим группам, было зафиксировано взаимодействие МЧ только со свободной РНК («хвост»), не связанной с БО. Однако удаление свободной РНК РНКазами приводит к тому, что большая часть МЧ взаимодействует с торцами вРНП. При сравнительном изучении распределения поверхностного заряда у трансляционно активированных вирионов ХВК, в ВМАльт и вРНП нам не удалось выявить разницу в распределении заряда у комплексов вирион/вРНП – транспортный белок 1(ТБ1) или у вирионов/вРНП с фосфорилированным БО с контрольными образцами.