![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Клетки животных изменяют свой объем в ответ на воздействие факторов, приводящих к изменениям осмолярности внеклеточной среды и/или цитоплазмы. Длительное уменьшение объема клеток может приводить к дисрегуляции их снабжения энергетическими субстратами, нарушению синтеза и метаболизма макромолекул и программируемой смерти клеток. Во избежание цитотоксических эффектов длительного увеличения внеклеточной осмолярности клетки ряда тканей обладают механизмом регуляторного увеличения объема (regulatory volume inrcrease, RVI), связанный с накоплением органических осмолитиков из внеклеточной среды за счет активации экспрессии генов, обеспечивающих Na+-сопряженный захват инозитола, бетаина и таурина. Установлено, что увеличение транскрипции этих и ряда других генов связано с активаций элемента осмотического ответа (osmotic-response element, ORE) или усилителя чувствительности тоничности (tonicity-responsive enhancer, TonE) через взаимодействие с белком TonEBP. Сравнительно недавно было обнаружено, что наряду с уменьшением объема, сжатие клеток вызывает увеличение соотношения внутриклеточных концентрации натрия и калия ([Na+]i/[K+]i). В нашей лаборатории было обнаружено, что увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i является достаточным условием для изменения экспрессии набора универсальных и тканеспецифических генов, включая гены, активирующиеся в гиперосмотических условиях. В этой связи в качестве рабочей гипотезы мы предполагаем, что наряду с активацией TonEBP уменьшение объема клеток приводит к изменению экспрессии генов через новый механизм сопряжения возбуждения и транскрипции, опосредованный увеличением соотношения [Na+]i/[K+]i. Для проверки этой гипотезы мы планируем провести 4 взаимосвязанных исследования. В первом исследовании, мы сравним действия гипер- и изоосмотического сжатия на концентрацию натрия и калия в клетках эпителия дистального отдела нефронов, астроцитов и макрофагов – клеток, испытывающих воздействие гипертонической среды in vivo. Во втором исследовании, мы идентифицируем Na+i,K+i-чувствительные гены, вовлеченные в изменения транскриптома при сжатии клеток. В третьем и четвертом исследовании мы изучим участие TonE и Са2+i в изменениях экспрессии Na+i,K+i-чувствительных генов при сжатии клеток. Данный проект должен расширить наши фундаментальных знания о механизмах вовлечения объема клетки в регуляцию транскрипции генов и привести к разработке новых подходов лечения болезней, сопровождающихся увеличением осмолярности внеклеточной жидкости, включая канцерогенез клеток эпителия, нарушения мозгового кровообращения головного мозга в условиях гипернатриемии, диабетическая ретинопатия.
In animal cells, the volume is sharply affected by changes of intra- and extracellular osmolality. The long-term cell volume decline leads to dysregulation of the supply by energy substrates, abnormalities of macromolecule synthesis and degradation and programmed cell death. To escape cytotoxic actions of sustained elevation of extracellular osmolality the overwhelming number of cell type developed mechanism of regulatory volume increase (RVI). This mechanism is mediated by accumulation of extracellular osmolytes via augmented expression of genes encoding Na+-coupled transporters of inositol, betaine and taurine. It was shown that augmented transcription of these and several other genes is mediated by activation of osmotic-response element (ORE) or tonicity-responsive enhancer (TonE) via its interaction with TonE-binding protein (TonEBP). Recently, it was also demonstrated that side-by-side with cell volume decrease cell shrinkage triggers elevation of the intracellular sodium/potassium ration ([Na+]i/[K+]i). More recently, we observed that elevation of the [Na+]i/[K+]i is sufficient for altered expression of the set of ubiquitous and cell type-specific genes including ones whose expression is activated in hypertonic conditions. Keeping these data collectively as a working hypotheses we propose that side-by-side with activation of TonEBP cell swelling leads to altered gene expression via a novel mechanism of excitation-transcription coupling mediated by elevation of the [Na+]i/[K+]i ratio. To examine this hypothesis, we plan to undertake 4 interconnected studies. Firstly, we will compare the action of hyper- and isosmotic shrinkage on sodium and potassium concentration in renal epithelial cells from distal tubule, astrocytes and macrophages, i.e. cells exposed to hypertonic environment in vivo. Secondly, we will identify the set of Na+i,K+i-sensitive genes contributing to transcriptomic changes triggered by cell shrinkage. In the third and forth investigations, we will study the relative contribution of TonE and Са2+i –mediated signaling in altered expression of Na+i,K+i-sensitive genes evoked by cell shrinkage. We firmly believe that our project contribute to the fundamental knowledge of mechanism of implication of cell volume changes in transcription regulation and lead to the development of new approaches for the therapeutic intervention for the treatment of diseases accompanied by elevation of the osmolality of extracellular fluids including the cancer of epithelial tissues, brain circulation disorders evoked by hypernatremia, diabetic retinopathy.
По завершению данного проекта мы планируем получить ряд важных результатов, позволяющих: 1. Сравнить действие гипер- и изоосмотического сжатия на концентрацию натрия и калия в клетках эпителия дистального отдела нефронов, астроцитов и макрофагов. 2. Идентифицировать Na+i,K+i-чувствительные гены, вовлеченные в изменения транскриптома при сжатии клеток. 3. Установить роль TonE в изменениях экспрессии Na+i,K+i-чувствительных генов при сжатии клеток. 4. Определить роль Ca2+i-опосредованного сигнального каскада в изменении экспрессии Na+i,K+i-чувствительных генов при сжатии клеток. На основании полученных результатов будет установлен Na+i,K+i-чувствительный механизм сопряжения возбуждения и транскрипции при сжатии клеток. Данный проект позволит расширить наши фундаментальных знания о механизмах вовлечения объема клетки в регуляцию транскрипции генов и привести к разработке новых подходов лечения болезней, сопровождающихся увеличением осмолярности внеклеточной жидкости, включая канцерогенез клеток эпителия, нарушения мозгового кровообращения головного мозга в условиях гипернатриемии, диабетическая ретинопатия. В данном проекте будет использован целый спектр современных методологических подходов молекулярной биологии, иммунологии, биохимии, биофизики и клеточной биологии, что, несомненно, позволит выполнить работу на высшем уровне и опубликовать полученные результаты в высокорейтинговых журналах.
Наша лаборатории занимает лидирующие позиции в исследовании Са2+-независимого механизма регуляции транскрипции, индуцированного увеличением соотношения [Na+]i/[K+]i. В рамках предыдущих проектов, поддержанных грантами РФФИ и РНФ, мы показали, что [Na+]i/[K+]i-индуцированный, Са2+-независимый механизм регуляции транскрипции имеет центральное значение в изменениях транскриптома при ишемических состояниях сосудов большего круга кровообращения и секреции миокинов клетками скелетной мускулатуры. Канадским институтом здоровья наша работа в этом направлении была оценена как медико-биологическое открытие 2013 года. Результаты этих исследований суммированы в обзоре, заказанном главным редактором Европейского физиологического журнала. Лаборатория коллектива исполнителей оснащена оборудованием для проведения исследований в области энзимологии, молекулярной биологии, иммунологии и биофизики. Имеется оборудование для электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот, Вестерн и Нозерн блоттинга, ПЦР в реальном времени, атомно-адсорбционный спектрофотометр и многое другое. Для выполнения проекта членам научной группы доступно оборудование, находящийся на Биологическом факультете МГУ имени М.В.Ломоносова, в том числе позволяющее проводить дифференциальное центрифугирование, ведение клеточной культуры, радиоактивный блок, приборы для оценки жизнеспособности клеток с использованием морфологических и биохимических подходов (фазово-контрастный и конфокальный микроскопы, спектрофотометр, планшетный сканер), а также для изучения ионного гомеостаза клетки (жидкостной сцинтилляционный счетчик, оптический сканер Storm 860). Сотрудничество с НИИ имени Белозерского и НИИ Общей Патологии и Патофизиологии позволяют проводить исследования в области протеомики и клеточной биологии (масс-спектрометр, проточная цитометрия). На территории Биологического факультета МГУ работает виварий, где есть все необходимое оборудование для содержания животных и проведения in vivo экспериментов.
В нашей лаборатории мы разработали метод одновременного измерения объема клеток и концентрации в них ионов с помощью предварительной их нагрузки флуоресцентным зондом. Измерение объема клеток проводили с помощью обновленной версии метода реконструкции поверхности на основе 2-х изображений (Double Image Surface Reconstruction Technique, DISUR) [2;3]. Cхема установки изображена на Рис. 1. Для предотвращения фотообесцвечивания красителя и предотвращения взаимодействия между изображением регистрируемом в белом свете и флуоресцентным изображением использовался красный светофильтр (Рис. 2), пропускающий длины волн более 645 нм (Thorlabs, Newton, NJ). Прикрепленные к покровному стеклу одиночные клетки были размещены внутри проточной камеры (5×10×25 мм3). Камера была расположена на рабочем столе инвертированного микроскопа NIKON TE300, оборудованного эпифлуоресцентным ультрафиолетовым освещением (Nikon Canada Inc., Mississauga, ON) (Рис. 2). На протяжении эксперимента клетки промывались раствором (37°С) со скоростью 0,5 мл/мин. После 15 мин промывания клеток изотоническим раствором клетки в течение 45 мин подвергались воздействию гипотонического раствора, осмолярность которого была снижена в 2 раза. Метод DISUR основан на фазово-контрастной цифровой видеомикроскопии и включает в себя трехмерное реконструирование формы одиночной клетки исходя из ее изображений, зарегестрированных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Вид сбоку и сверху получали с помощью объективов 10X и 40X соответственно. Изображения сбоку и сверху регистрировались каждые 15 секунд посредством двух миниатюрных цифровых камер (Moticam 352, Motic Instruments Inc., Richmond, BC; mvBlueFOX, Matrix Vision, Oppenweiler, Germany). Вертикальная ось, проходящая через центр ядра клетки, делит профиль клетки на 2 половины. В MATLAB (MathWorks, Inc., Natick, MA) контур основы клетки при виде сверху оцифровывался вручную (всего m точек), а профиль изображения клетки сбоку оцифровывался посредством последовательного приближения к функции, являющейся полиномом 5-ой степени (метод наименьших квадратов). Уравнение, задаваемое функцией, было использовано для генерации набора из n равноудалённых точек вдоль оси z. Этот набор точек будет являться начальными координатами для построения n-1 клеточных срезов с контуром основы клетки принятым за шаблон. Для построения каждого среза m-1 точка были экстраполированы от такой начальной координаты. Положение экстраполированной точки определяется методом, основанном на паре параллельных векторов. Две соседние точки в контуре основы образуют вектор (vij), являющийся отправным для аналогичного вектора, лежащего в срезе выше (v(i+1)j). Начальная точка вектора в следующем срезе известна из данных по оцифровке профиля клетки. Величина и направление искомого вектора находятся, основываясь на допущениях, что выше упомянутые вектора параллельны и что вектор v(i+1)j пропорционален по модулю вектору vij в соответствии с его расстоянием от вертикальной оси. Зная величину вектора v(i+1)j, легко определить координаты его конечной точки Процесс экстраполяции повторяется шаг за шагом до тех пор, пока новый срез, состоящий из m точек завершён. Результатом проделанных манипуляций должны быть срезы клетки, соответствующие сечениям плазматической мембраны вдоль оси z. Пример оцифровки изображений и конечный результат представлены на рис. 3В. Полученные реконструкции клеточных моделей позволяют рассчитать объем клетки в MATLAB (MathWorks, Inc., Natick, MA). Клеточный объём аппроксимируется суммой n-1 элементарных объемов Vi, каждый из которых является приближением пространства, ограниченного двумя прилегающими плоскостями и клеточной поверхностью. Уравнение (1) описывает поперечное сечение клетки inti. Уравнение (2) служит описанием элементарного объема, который является результатом произведения усреднения двух прилегающих площадей поперченого сечения (inti + inti+1) на расстояние, разделяющее эти плоскости ∆z. Объём всей клетки V рассчитывается с помощью уравнения (3) и является суммированием всех элементарных объемов Vi . (1) (2) (3) Для регистрации изменений [Са2+]i прикрепленные к покровному стеклу клетки инкубировались 60 мин при 37°C в среде без фенола красного DMEM/F-12(1:1) (HyClone, Logan, UT) содержащей 10 мкМ Fura-2-АМ и промывались 30 мин в той же среде, не содержащей Fura-2-АМ. На следующем этапе стекло с клетками А549 помещалось в перфузируемую камеру, где они подвергались облучению (300 мс), генерируемому ртутной лампой высокого давления (100 W, Osram GmbH, Germany) при 340нм или 380 нм с помощью интерференционных светофильтров (Chroma Technology, Brattleboro, VT), встроенных на вращающееся колесо (Sutter Lambda 10-C, Sutter Instrument, Novato, CA). Флуоресцентные изображения записывались с 15 сек интервалом с помощью цифровой камеры MicroMAX (Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ). В конце эксперимента для регистрация максимального уровня флуоресценции концентрацию внутриклеточного кальция увеличивали добавлением 10 мкМ Са2+ ионофора иономицина. Изменения концентрации кальция регистрировались в виде изменения соотношения флуоресценции fura-2, зарегистрированной при 340 нм к 380 нм. Соотношение флуоресценций F340/F380 нормализировалось к начальному значению до стимуляции клеток 50% гипотоническим шоком. Более детально метод описан в работе [4]. Используя этот метод, мы сравнили влияние гиперосмотического сжатия, вызванного добавлением 150 мМ маннитола или увеличением концентрации NaCl от 110 до 185 мМ, а также изоосмотического сжатия при переносе клеток эндотелия человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) из гипосмотической в изоосмотическую среду. Данные этого эксперимента приведены на Рисунке 4. На основании полученных данных были отобраны кинетические точки, обозначенные на этом рисунке как *, для которых были собраны образцы для измерения внутриклеточного содержания натрия и калия с помощью метода атомно-абсорбционной спектрометрии. В дополнительных экспериментах мы изучили дозо-зависимое действие на внутриклеточное содержание натрия и калия ингибитора Na+,K+-АТФазы уабаина. С этой целью, клетки помещали на лед 6 и промывали 3 раза 0.1 M MgCl2 раствором, приготовленном на дважды деионизованной воде после чего их лизировали раствором 5% трихлоруксусной кислоты. После осаждения осадок использовали для определения содержания белка по методу Лоури, а супернатант для измерения содержания натрия и калия с помощью спектрометра Kvant-2m1 (Cortec, Russia) и смеси пропан-воздух. Более детально этот метод описан нами ранее [5]. К настоящему времени нами получено более 400 образцов.. После завершения измерений, которые мы планируем закончить к середине декабря 2018, будет подготовлена статья к публикации и составлен детальный план экспериментов на 2019 г (см. ниже).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Объем клеток как фактор регуляции экспрессия генов: роль Na+i,K+i-чувствительного механизма сопряжения возбуждения и транскрипции |
Результаты этапа: В нашей лаборатории мы разработали метод одновременного измерения объема клеток и концентрации в них ионов с помощью предварительной их нагрузки флуоресцентным зондом. Измерение объема клеток проводили с помощью обновленной версии метода реконструкции поверхности на основе 2-х изображений (Double Image Surface Reconstruction Technique, DISUR) [2;3]. Cхема установки изображена на Рис. 1. Для предотвращения фотообесцвечивания красителя и предотвращения взаимодействия между изображением регистрируемом в белом свете и флуоресцентным изображением использовался красный светофильтр (Рис. 2), пропускающий длины волн более 645 нм (Thorlabs, Newton, NJ). Прикрепленные к покровному стеклу одиночные клетки были размещены внутри проточной камеры (5×10×25 мм3). Камера была расположена на рабочем столе инвертированного микроскопа NIKON TE300, оборудованного эпифлуоресцентным ультрафиолетовым освещением (Nikon Canada Inc., Mississauga, ON) (Рис. 2). На протяжении эксперимента клетки промывались раствором (37°С) со скоростью 0,5 мл/мин. После 15 мин промывания клеток изотоническим раствором клетки в течение 45 мин подвергались воздействию гипотонического раствора, осмолярность которого была снижена в 2 раза. Метод DISUR основан на фазово-контрастной цифровой видеомикроскопии и включает в себя трехмерное реконструирование формы одиночной клетки исходя из ее изображений, зарегестрированных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Вид сбоку и сверху получали с помощью объективов 10X и 40X соответственно. Изображения сбоку и сверху регистрировались каждые 15 секунд посредством двух миниатюрных цифровых камер (Moticam 352, Motic Instruments Inc., Richmond, BC; mvBlueFOX, Matrix Vision, Oppenweiler, Germany). Вертикальная ось, проходящая через центр ядра клетки, делит профиль клетки на 2 половины. В MATLAB (MathWorks, Inc., Natick, MA) контур основы клетки при виде сверху оцифровывался вручную (всего m точек), а профиль изображения клетки сбоку оцифровывался посредством последовательного приближения к функции, являющейся полиномом 5-ой степени (метод наименьших квадратов). Уравнение, задаваемое функцией, было использовано для генерации набора из n равноудалённых точек вдоль оси z. Этот набор точек будет являться начальными координатами для построения n-1 клеточных срезов с контуром основы клетки принятым за шаблон. Для построения каждого среза m-1 точка были экстраполированы от такой начальной координаты. Положение экстраполированной точки определяется методом, основанном на паре параллельных векторов. Две соседние точки в контуре основы образуют вектор (vij), являющийся отправным для аналогичного вектора, лежащего в срезе выше (v(i+1)j). Начальная точка вектора в следующем срезе известна из данных по оцифровке профиля клетки. Величина и направление искомого вектора находятся, основываясь на допущениях, что выше упомянутые вектора параллельны и что вектор v(i+1)j пропорционален по модулю вектору vij в соответствии с его расстоянием от вертикальной оси. Зная величину вектора v(i+1)j, легко определить координаты его конечной точки Процесс экстраполяции повторяется шаг за шагом до тех пор, пока новый срез, состоящий из m точек завершён. Результатом проделанных манипуляций должны быть срезы клетки, соответствующие сечениям плазматической мембраны вдоль оси z. Пример оцифровки изображений и конечный результат представлены на рис. 3В. Полученные реконструкции клеточных моделей позволяют рассчитать объем клетки в MATLAB (MathWorks, Inc., Natick, MA). Клеточный объём аппроксимируется суммой n-1 элементарных объемов Vi, каждый из которых является приближением пространства, ограниченного двумя прилегающими плоскостями и клеточной поверхностью. Уравнение (1) описывает поперечное сечение клетки inti. Уравнение (2) служит описанием элементарного объема, который является результатом произведения усреднения двух прилегающих площадей поперченого сечения (inti + inti+1) на расстояние, разделяющее эти плоскости ∆z. Объём всей клетки V рассчитывается с помощью уравнения (3) и является суммированием всех элементарных объемов Vi . (1) (2) (3) Для регистрации изменений [Са2+]i прикрепленные к покровному стеклу клетки инкубировались 60 мин при 37°C в среде без фенола красного DMEM/F-12(1:1) (HyClone, Logan, UT) содержащей 10 мкМ Fura-2-АМ и промывались 30 мин в той же среде, не содержащей Fura-2-АМ. На следующем этапе стекло с клетками А549 помещалось в перфузируемую камеру, где они подвергались облучению (300 мс), генерируемому ртутной лампой высокого давления (100 W, Osram GmbH, Germany) при 340нм или 380 нм с помощью интерференционных светофильтров (Chroma Technology, Brattleboro, VT), встроенных на вращающееся колесо (Sutter Lambda 10-C, Sutter Instrument, Novato, CA). Флуоресцентные изображения записывались с 15 сек интервалом с помощью цифровой камеры MicroMAX (Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ). В конце эксперимента для регистрация максимального уровня флуоресценции концентрацию внутриклеточного кальция увеличивали добавлением 10 мкМ Са2+ ионофора иономицина. Изменения концентрации кальция регистрировались в виде изменения соотношения флуоресценции fura-2, зарегистрированной при 340 нм к 380 нм. Соотношение флуоресценций F340/F380 нормализировалось к начальному значению до стимуляции клеток 50% гипотоническим шоком. Более детально метод описан в работе [4]. Используя этот метод, мы сравнили влияние гиперосмотического сжатия, вызванного добавлением 150 мМ маннитола или увеличением концентрации NaCl от 110 до 185 мМ, а также изоосмотического сжатия при переносе клеток эндотелия человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) из гипосмотической в изоосмотическую среду. Данные этого эксперимента приведены на Рисунке 4. На основании полученных данных были отобраны кинетические точки, обозначенные на этом рисунке как *, для которых были собраны образцы для измерения внутриклеточного содержания натрия и калия с помощью метода атомно-абсорбционной спектрометрии. В дополнительных экспериментах мы изучили дозо-зависимое действие на внутриклеточное содержание натрия и калия ингибитора Na+,K+-АТФазы уабаина. С этой целью, клетки помещали на лед 6 и промывали 3 раза 0.1 M MgCl2 раствором, приготовленном на дважды деионизованной воде после чего их лизировали раствором 5% трихлоруксусной кислоты. После осаждения осадок использовали для определения содержания белка по методу Лоури, а супернатант для измерения содержания натрия и калия с помощью спектрометра Kvant-2m1 (Cortec, Russia) и смеси пропан-воздух. Более детально этот метод описан нами ранее [5]. К настоящему времени нами получено более 400 образцов.. После завершения измерений, которые мы планируем закончить к середине декабря 2018, будет подготовлена статья к публикации и составлен детальный план экспериментов на 2019 г (см. ниже). | ||
2 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Объем клеток как фактор регуляции экспрессия генов: роль Na+i,K+i-чувствительного механизма сопряжения возбуждения и транскрипции |
Результаты этапа: Данные, полученные с помощью техники DISUR, показывают, что увеличение осмолярности среды при добавлении 150 мM маннитола сопровождалось быстрым 2-х кратным уменьшением объема клеток HUVEC (Рис. 1). Как и в случае эпителиальных клеток [7;11;12], изначальное сжатие HUVEC сопровождалось медленным регуляторным увеличением объема (regulatory volume increase, RVI). В отличие от гиперосмотического сжатия изначальное набухание клеток эндотелия в гипоосмотической среде приводило к быстрому регуляторному уменьшение объема (regulatory volume decrease, RVD) и через 15 мин их объем восстанавливался до исходных значений. Как и в случае всех клеток животного происхождения, перенос HUVEC из гипо- в изоосмотическую среду приводил к долгосрочному уменьшению их объема на 40-50% (Рис. 1) - феномене, получившим название изоосмотического сжатия [13;14]. Как видно из Таблицы 1, изоосмотическое сжатие уменьшало содержание внутриклеточного натрия, измеренного с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии (нмоль/мг белка) на ~40%, в то время как гиперосмотическое сжатие увеличивало этот параметр на ~15%. Оба воздействия уменьшали содержание внутриклеточного калия на ~35%, но эти различия не были статистически достоверны. Для пересчета на значения внутриклеточной концентрации этих катионов (ммоль/л), мы измерили объем внутриклеточной воды как объем пространства, доступного для 14C-мочевины, свободно проникающей через плазматическую мембраны. С помощью этого подхода мы обнаружили, что гиперосмотическое сжатие увеличивало [Na+]i в 2 раза при отсутствии достоверного влияния на этот параметр изоосмотического сжатия (Tаблица 1). Для оценки роли увеличения [Na+]i в регуляции транскрипции генов мы использовали среду, лишенную натрия, и селективный ингибитор Na+,K+-ATРазы уабаин. Замещение в изоосмотической среде NaCl на NMDG не влияло на объем клеток, но полностью устраняло [Na+]i, вызванный добавкой маннитола (Таблица 1). В соответствии с предыдущими данными [15], увеличение концентрации уабаина в диапазоне от 0,03 до 3 M сопровождалось дозозависимым ингибированием Na+,K+-ATРазы, регистрируемой по приросту содержания Na+ и потере K+ (Рис. 2). Мы обнаружили, что при концентрации 0,1 M уабаин увеличивает [Na+]i от 15,6 до 33,3 ммоль/л внутриклеточной воды, что соответствует приросту [Na+]i в условиях гиперосмотического сжатия. В отличие от гиперосмотического сжатия 0,1 M уабаин не оказывал влияние на объем HUVEC (Tаблица 1). В предыдущих исследованиях мы сравнили изменения транскриптома в нескольких типах клеток, включая HUVEC, и обнаружили несколько десятков генов, чья экспрессия изменялась от 3 до 20 раз в ответ на [Na+]i при ингибировании Na+,K+-ATPaзы уабаином или безкалиевой средой. Мы обратили внимание на то, что список этих универсальных Na+i-чувствительных транскриптов обогащен генами раннего ответа (ERGs) [2;16]. Учитывая, что при 1-часовой инкубации HUVEC в гиперосмотической среде и в присутствии 0,1 M уабаин вызывает одинаковый прирост [Na+]i (Таблица 1), мы сопоставили действие этих стимулов на содержание мРНК Na+i-чувствительных ERGs (EGR1, FOS, ATF3, ZFP36 и JUN), обнаруженных в предыдущих исследованиях. Как уабаин, так и гиперосмотическое сжатие приводили к существенному увеличению содержания мРНК всех исследовавшихся ERGs (Рис. 3). Более того мы обнаружили высоко достоверную (p=0.0005) положительную (R2=0.9383) корреляцию между уровнем прироста содержания транскриптов в ответ на действие этих стимулов (Рис. 4). Замена в среде инкубации Na+ на NMDG полностью устраняло действие гиперосмотической среду на транскрипцию c ERGs. В отличие от гиперосмотического сжатия мы не обнаружили достоверного действия изоосмотического сжатия на содержание ERGs (Рис. 3). Таким образом, полученные в 2019 году результаты свидетельствую о том, что увеличение концентрации внутриклеточного Na+ в клетках эндотелия является ключевым фактором изменения транскрипции пяти ключевых генов раннего ответа (ERGs). Этот вывод подтверждается следующими наблюдениями. Первое, гиперосмотическое сжатие приводит к 2-х кратному увеличению [Na+]i и увеличению содержания мРНК ZFP36, EGR1, FOS, ATF3 и JUN мРНК (Таблица 1, Рис. 1, 3). Второе, обнаружена достоверная корреляция между уровнем прироста содержания ERGs в условиях одинакового прироста [Na+]i: при гиперосмотическом сжатии и ингибировании Na+,K+-ATPазы в присутствии 0,1 M уабаина (Таблица 1, Рис. 4). Третье, в отличие от гиперосмотической среды ни [Na+]i, ни экспрессия ERG не изменялись в условиях изоосмотического сжатия (Таблица 1, Рис. 3). Четвертое, замена в среде инкубации Na+ на NMDG полностью устраняло действие гиперосмотической среды на транскрипцию и прирост [Na+]i не изменяя динамику изменения объема клеток в ответ на добавление маннитола (Таблица 1, Рис. 3). В 2019 году в рамках данного РФФИ гранта были опубликованы следующие работы: С1. Shiyan Alexandra A., Sidorenko Svetlana V., Fedorov Dmitry A., Klimanova Elizaveta A.,Smolyaninova Larisa V., Kapilevich Leonid V., Ryszard Grygorczyk, Orlov Sergei N. Elevation of Intracellular Na+ Contributes to Expression of Early Response Genes Triggered by Endothelial Cell Shrinkage Cellular Physiology and Biochemistry, 2019 53, № 4, 638-647 2. Климанова Е.А., Сидоренко С.В., Тверской А.М., Шиян А.А., Смольянинова Л.В., Капилевич Л.В., Гусакова С.В., Максимов Г.В., Лопина О.Д., Орлов С.Н. Поиск внутриклеточных сенсоров, вовлеченных в функционирование одновалентных катионов как вторичных посредников Биохимия, 2019 84, № 11, 1592-1609 3. Smolyaninova Larisa V., Shiyan Alexandra A., Kapilevich Leonid V., Lopachev Alexander V.,Fedorova Tatiana N., Klementieva Tatiana S., Moskovtsev Aleksey A., Kubatiev Aslan A., Orlov Sergei N. Transcriptomic changes triggered by ouabain in rat cerebellum granule cells: role of alpha3- and alpha1-Na+,K+-ATPase-mediated signaling PLoS ONE, 2019 14, № 9, 1-23 4. Смольянинова ЛВ, Шиян АА, Клементьева ТС, Московцев АА, Кубатиев АА, ОРЛОВ СН Уабаин в низких концентрациях изменяет транскрипцию, не влияя на содержание натрия и калия в нейронах мозга крысы Биологические мембраны, 2019 36, № 5, 373-380 5. Dulin Nickolai O., Smolyaninova Larisa V., Orlov Sergei N. Control of lung myofibroblast transformation by monovalent ion transporters Current topics in membranes, 2019 6. Смольянинова Л.В., Шиян А.А., Сидоренко С.В., Клементьева Т.С., Кубатиев А.А., Московцев А.А., Орлов С.Н. Влияние уабаина на внутриклеточное содержание натрия, калия и транскриптом в нейронах мозга крыс 10 международная конференция 2019 "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", том 1, тезисы, с. 283-288 7. Орлов С.Н., Сидоренко С.В., Лопина О.Д., Смольянинова Л.В., Шиян А.А., Тверской А.М., Климанова Е.А. Одновалентные катионы как вторичные посредники: поиск сенсоров, вовлеченных в регуляцию транскрипции 10 международная конференция 2019 "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", том 1, тезисы, с. 67-71 8. Климанова Е.А., Сидоренко С.В., Смольянинова Л.В., Лопина О.Д., Орлов С.Н. Изменения транскриптома в клетках грызунов, вызванные диссипацией трансмембранного градиента одновалентных катионов 10 международная конференция 2019 "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", том 1, тезисы, с. 40-43 | ||
3 | 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Объем клеток как фактор регуляции экспрессия генов: роль Na+i,K+i-чувствительного механизма сопряжения возбуждения и транскрипции |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | рисунки | Figures_RSCF_2019.pptx | 67,5 КБ | 13 января 2020 [Shiyan_Aleksandra] |