ИСТИНА

Проект направлен на подробное изучение сущности и механизмов мало исследованного явления синергизма влияния различных компонентов плазмы крови на агрегацию эритроцитов в норме и при различных патологиях. Детальное изучение этого явления с одной стороны важно для понимания фундаментальных механизмов агрегации эритроцитов, а с другой стороны может найти широкое применение в клинической практике для прогноза развития гемореологических и микроциркуляторных расстройств по составу компонентов плазмы крови. Будут проведены многосерийные комплексные эксперименты по измерению параметров агрегации эритроцитов в пробах цельной крови с использованием с использованием оптических методов и приборов: лазерного агрегометра РеоСкан (Корея) (измерение амплитуды спонтанной агрегации, времени спонтанной агрегации, критического напряжения сдвига для разрушения агрегатов) и на одиночных клетках с помощью лазерного пинцета собственной разработки и изготовления (измерение силы агрегации и дезагрегации при образовании и разрушении парных агрегатов, скорости агрегации, прочности парных агрегатов). В отличие от агрегометрии цельной крови, при которой измерения будут проводиться одновременно на большом числе клеток, измерения с помощью лазерного пинцета (оптических ловушек) будут проводиться на индивидуальных эритроцитах и агрегатах. Метод позволяет получить зависимости сил взаимодействия эритроцитов от времени и площади перекрытия взаимодействующих эритроцитов в различных условиях, а также исследовать агрегацию, как процесс образования и разрушения агрегата, т.е. его дезагрегацию, введя важную характеристику прочности агрегатов. Эта характеристика является ключевой для понимания механизма взаимодействия эритроцитов. Большинство методик измерения этих параметров разработаны авторами данного проекта или с их участием.

The project is aimed at a detailed study of the nature and mechanisms of the little studied phenomenon of synergism of the effect of various components of blood plasma on erythrocyte aggregation in norm and in various pathologies. Detailed study of this phenomenon on the one hand is important for understanding the fundamental mechanisms of erythrocyte aggregation, and on the other hand it can be widely used in clinical practice to predict the development of hemorheological and microcirculatory disorders in the composition of plasma components. Multiseries integrated experiments on the measurement of erythrocyte aggregation parameters in whole blood samples using optical methods and instruments: ReoScan laser instrument (Korea) (amplitude measurement spontaneous aggregation, spontaneous aggregation time, critical shear stress to destroy aggregates) and on single cells using laser tweezers of own design and manufacture (measuring aggregation and disaggregation forces during formation and destruction of paired aggregates, aggregation speed, strength of paired aggregates). Unlike whole blood aggregometry, in which measurements will be performed simultaneously on a large number of cells, measurements using laser tweezers (optical traps) will be performed on individual erythrocytes and aggregates. The method makes it possible to obtain the dependence of the erythrocytes interaction forces on time and the overlapping area of ​​interacting erythrocytes under different conditions, and also to study aggregation as the process of formation and destruction of the aggregate, i.e. its disaggregation, introducing an important characteristic of the strength of aggregates. This characteristic is key to understanding the mechanism of erythrocyte interaction. Most methods of measuring these parameters were developed by the authors of this project or with their participation.

- Будет проведено сравнение различных “сценариев” агрегации и дезагрегации клеток при изменении состава суспендирующих растворов и плазмы. - Будет проведено исследование АЭ разными методами в условиях ингибирования вероятных рецепторов. Исследование вклада ионов кальция в процесс объединения клеток путем стимулирования и блокирования входа Са2+ в эритроциты. - Будет проведено комплексное изучение влияния разных компонентов плазмы крови по отдельности на АЭ в зависимости от их концентрации в растворе в пределах её физиологических значений, а также при их нахождении в растворе в различных сочетаниях. - Будет проведено изучение изменений параметров АЭ в плазме при искусственном изменении в ней концентрации различных компонентов, а также изучение характера взаимодействия компонентов плазмы крови с мембраной эритроцитов в отдельности и в различных сочетаниях. - Будет проведено сравнительное изучение различий в параметрах АЭ в плазме крови здоровых доноров и больных людей с аномальными значениями концентрации различных компонентов плазмы. - Будут выполнены и сопоставлены, а также проведен сравнительный анализ многопараметрических образов - распределений значений параметров АЭ и других характеристик образцов крови для различных групп испытуемых. Будут выявлены “узкие места” и наиболее критических параметры. - Будет проведен комплексный анализ получаемых результатов и выделение параметров АЭ, наиболее явно характеризующих явление синергизма влияния на АЭ различных компонентов плазмы крови. - Будет проведен корреляционный анализ полученных зависимостей параметров АЭ от состава суспендирующей среды и выявление эффектов синергизма. Будут разработаны модели участия различных компонентов плазмы крови в процессе взаимодействия эритроцитов с проявлением эффекта синергизма, а также новая более продвинутая модель взаимодействия эритроцитов крови при их обратимой агрегации в нативной плазме и в средах с другим составом молекул.

1) выполнен цикл работ по численному моделированию взаимодействия лазерного излучения с компонентами крови и моделирующими их частицами; 2) разработаны новые оптические методики, основанные главным образом на диффузном рассеянии и дифракции света, и позволяющие выделять и измерять набор информативных параметров, характеризующих микрореологические (агрегационные и дкформационные свойства эритроцитов в пробах цельной крови и в разбавленных суспензиях (in vitro); 3) проведены циклы работ c использованием разработанных методов по анализу микрореологических свойств эритроцитов человека и малых лабораторных животных (крыс) в норме и при различных патологиях. Впервые установлено, что у людей, страдающих рядом заболеваний (например, острым нарушением мозгового кровообращения) скорость образования линейных агрегатов эритроцитов значительно выше (в среднем на 50%), чем у здоровых. Прочность агрегатов у больных людей по сравнению со здоровыми, также выше (в среднем на 10%). Исследован синдром гиперагрегации эритроцитов в крови больных сахарным диабетом. У крыс обнаружено уменьшение деформируемости эритроцитов при острых нарушениях мозгового кровообращения, вызванных экспериментально. Нами впервые установлено, что инкубация крови крыс с экспериментальной ишемией головного мозга in vitro с пептидным препаратом семакс, обладающим антигипоксическим и нейропротекторным действием, улучшает деформируемость эритроцитов. 4) впервые проведены комплексные исследования в опытах in vitro и in vivo по влиянию углеродных наночастиц на микрореологические свойства крови у лабораторных животных и человека. Показано, что в зависимости от размеров и концентрации частиц, а также от свойств их поверхности возможно отрицательное влияние наноалмазов на деформируемость и агрегационные параметры красных клеток крови человека.

В соответствии с заявленным Планом работ на 1 год выполнения проекта были получены следующие результаты. Были проведены серии измерений параметров агрегации эритроцитов (АЭ) в различных проагрегантных средах (в аутологичной нативной плазме без тромбоцитов; в плазме и в модельных растворах при различной концентрации макромолекул клеточной адгезии). Измерения проводились двумя методами: с помощью агрегометрии образцов ресуспендированной цельной крови на уровне больших ансамблей клеток и с помощью лазерных пинцетов (ЛП) на уровне отдельных клеток при образовании и разрушении парных агрегатов в сильноразбавленной (гематокрит 0,05%) клеточной суспензии. Данные по результатам экспериментов позволили разработать оригинальные методики подготовки клеточных образцов для измерения параметров АЭ различными методами. Протоколы данных методик учитывают как общие условия получения и хранения образцов цельной крови и подготовки плазмы, так и особенности реализуемых экспериментальных подходов. Были проведены измерения особенностей взаимодействия эритроцитов при дезагрегации парных агрегатов с помощью ЛП с фиксированной оптической силой 8,1 ± 0,2 пН. Оптической силой является сила оптического захвата эритроцита со стороны лазерного пинцета при фиксированной мощности лазерного пучка. Измеряемой в ходе эксперимента величиной является вероятность полной дезагрегации дублета эритроцитов. Вероятность дезагрегации парного агрегата вычисляется как отношение числа актов полной дезагрегации дублета клеток к общему числу попыток разделить агрегат при заданной оптической силе (мощности пучка). Для каждого значения концентрации во всех случаях общее количество пар различных эритроцитов и, соответственно, число попыток составляет N = 20. Если вероятность разделения парного агрегата (вероятность дезагрегации) уменьшается, то это свидетельствует об усилении агрегации клеток. При концентрациях фибриногена в плазме в диапазоне 2,7 – 6 мг\мл увеличение концентрации альбумина с 40 до 80 мг\мл приводит к уменьшению вероятности дезагрегации. Однако при высокой концентрации фибриногена ( >6 мг\мл), которая тем не менее является верхней границей физиологических значений, увеличение концентрации альбумина приводит к явному увеличению вероятности разделить парный агрегат. Таким образом, при высоком уровне фибриногена в плазме альбумин изменяет свою роль и становится ингибитором агрегации. Данный результат соотносится с данными из медицинской практики, когда пациентам при повышенном фибриногене (например, в следствие воспалительного процесса) вводят альбумин для уменьшения вязкости («разжижения») крови. Силы взаимодействия эритроцитов при спонтанной агрегации и вынужденной дезагрегации в сыворотке крови (плазме без фибриногена) были измерены с помощью ЛП. Было обнаружено, что в сыворотке наблюдается значительное (трехкратное) уменьшение сил взаимодействия и при агрегации (сила агрегации FA), и при дезагрегации (сила дезагрегации FD) по сравнению с аналогичными измерениями в плазме: в сыворотке FA = 0,5 ± 0,2 пН (1,5 ± 0,2 пН в плазме) и FD = 2,1 ± 0,2 пН (6,4 ± 1,0 пН в плазме). Получены зависимости изменения площади перекрытия эритроцитов от времени в процессе образования парного агрегата (иными словами, скорость, с которой один эритроцит «наползает» на другой при образовании агрегата). И в плазме, и в сыворотке эти зависимости с высокой достоверностью имеют линейный вид. Это говорит о том, что скорость «наползания» клеток линейно зависит от площади изначального перекрытия при образовании парного агрегата.