ИСТИНА

Детектирование температуры на уровне микро- и наноразмерных объектов (в том числе в живых тканях, клетках и органеллах) является важной задачей для ряда биотехнологических и биомедицинских проблем. Поскольку температура отражает энергетический статус клетки, возможность её регистрации открывает новые направления для изучения физиологических процессов, их регуляции и нарушений. Для решения этих задач необходимы новые функциональные материалы. Ранее нашей научной группой было установлено, что скорость фотоконверсии оранжевого каротиноидного белка зависит от температуры среды. Нами впервые были предложены методы регистрации данных кинетических параметров не только с помощью изменений поглощения хромофора, но также с помощью флуоресцентных зондов, как встраиваемых в белковую матрицу, так и внутренних (триптофановая флуоресценция). В рамках данного проекта мы предлагаем создать химерную конструкцию на основе фотоактивного оранжевого каротиноидного белка и ряда флуоресцентных белков. Полученные конструкции будут использованы для разработки датчика температуры, который будет апробирован в различных средах in vitro, а затем перенесен в эукариотическую клеточную линию для создания модельной системы, позволяющей визуализировать температуру в различных частях клетки.

Detection of temperature at the level of micro- and nanoscale objects (including in living tissues, cells and organelles) is an important task for a number of biotechnological and biomedical problems. Since the temperature reflects the energy status of the cell, the possibility of its registration opens up new directions for studying physiological processes, their regulation and disturbances. To solve these problems, new functional materials are needed. Earlier, our research team found that the rate of photoconversion of the orange carotenoid protein depends on the temperature of the medium. We have for the first time proposed methods for recording these kinetic parameters not only with the help of changes in the absorption of the chromophore, but also with the help of fluorescent probes, both embedded in the protein matrix and internal (tryptophan fluorescence). Within the framework of this project, we propose to create a chimeric construction based on the photoactive orange carotenoid protein and a number of fluorescent proteins. The resulting designs will be used to develop a temperature sensor that will be tested in various environments in vitro and then transferred to a eukaryotic cell line to create a model system that allows visualizing the temperature in various parts of the cell.

Мы предлагаем разработать белковую конструкцию и метод определения локальных температур основанный на регистрации скорости конверсии фотоактивного белка ОСР. Зависимость скорости конверсии ОСР от температуры была изучена нами ранее на диком типе белка, как с помощью стационарной спектроскопии, так и методов высокого временного разрешения. Также изучены свойства комплексов ОСР и некоторых гидрофобных флуоресцентных красителей (Nile red). Далее нами были изучены свойства ОСР меченого тетраметилродамином по цистеиновым остаткам. Полученные результаты говорят о чрезвычайно высокой чувствительности вышеперечисленных спектрально-кинетических параметров от температуры в физиологическом диапазоне температур. Введение в структуру ОСР флуоресцентного зонда, чувствительного к изменению конформации ОСР в ответ на свет высокой интенсивности, позволяет регистрировать скорость конверсии при помощи простых и распространённых методов флуориметрии. Данный подход, обладает рядом преимуществ: 1. По своей структуре датчик температуры является высокостабильным водорастворимым белком (мотивы фолдинга которого похожи на многие другие белки, в том числе сигнал ядерной локализации-2), таким образом ОСР может сохранять фотоактивность находясь в цитоплазме и/или различных органоидах. 2. Поскольку связанный с температурой параметр (скорость конверсии) не зависит от абсолютных значений интенсивности флуоресценции и квантового выхода, а лишь от скорости их изменения, методика регистрации не требует учета концентрации ОСР и реализуема с помощью большинства современных конфокальных микроскопов с CCD камерами, обеспечивающими скорость съемки от 1 кадра в секунду. 3. Поскольку ОСР обладает уникальной чувствительностью к интенсивности света и кинетикой фотоконверсии, измерения возможны в присутствии других флуоресцентных красителей для получения многомерных и комбинированных изображений. 4. Структура ОСР может быть модифицирована для введения специальных функциональных доменов, обеспечивающих интернализацию и накопление в строго определенных частях клеток. Безотносительно к применимости ОСР к визуализации температуры в клетках и тканях, данный белок может быть применен для изучения локальных изменений температуры вблизи таких модельных объектов как магнитные наночастицы. Эта задача может быть решена в рамках данного проекта для доказательства возможности применения метода определения локальных температур по скорости фотоконверсии. В случае успешного испытания химерных конструкций на основе ОСР и флуоресцентных белков in vitro, мы перейдем к созданию клеточной линии способной экспрессировать химерную конструкцию и накапливать её в различных частях клетки. В результате будет получена модельная система, которая позволит визуализировать изменения температуры в различных частях клетки с помощью флуоресцентной микроскопии.

В нашей работе (Biophysical Journal, 2015) была показана температурная зависимость скорости фотоактивации и последующей релаксации ОСР от температуры. Так, например скорость релаксации снижается практически на два порядка при изменении температуры от 30 до 10 С. Полученные температурные зависимости позволяют решать обратную задачу, т.е. определение температуры среды по скорости фотоконверсии. Однако для успешного применения данного метода на практике необходимо решение нескольких задач: 1. Регистрация изменений поглощения требует высокой концентрации белка-сенсора, а также оборудования для регистрации оптической плотности, которое не всегда применимо к клеточным системам. Поэтому мы считаем необходимым введение в структуру ОСР флуоресцентного модуля, чувствительного к изменениям конформации белка и, соответственно, температуры. Перспективность данного подхода была подтверждена нами с помощью селективного мечения цистеиновых остатков ОСР тетраметилродамином (Biophysical Journal, 2015). Однако использование конструкций на основе эндогенных флуоресцентных органических красителей для микроскопии сопряжено с многими трудностями, в первую очередь с доставкой ОСР-TMR в клетку. Поэтому мы предлагаем введение в структуру ОСР флуоресцентных модулей на основе флуоресцентных белков. Для решения этой задачи могут быть использованы различные флуоресцентные белки (GFP, CFP, YFP, RFP), которые могут быть введены в структуру химерной конструкции на различных концах ОСР.

В рамках проекта будут выполнены следующие работы: 1. С помощью методов молекулярной биологии будет получена химерная конструкция из фотоактивного оранжевого каротиноидного белка и флоуресцентных белков. 2. Будет проведено исследование фото-физических параметров системы и установлена корреляция между характеристиками флуоресценции флуоресцентных белков, скоростью конформационных переходов в оранжевом каротиноидном белке и температурой. 3. Будет проведена оптимизация структуры химеры (подбор типа флуоресцентного белка и длинны линкеров между модулями, сигналы клеточной локализации) для получения наилучшей чувствительности к изменениям температуры. 4. Будет осуществлен перенос генов, кодирующих химерную конструкцию и систему синтеза кето-каротиноидов в эукариотические клетки для создания линии клеток с эндогенными датчиками температуры.