Структура бактериальных сообществ в разных элементах микрорельефа верхового торфяника

Добровольская, Т.Г.; Якушев, А.В.; Юрченко, Е.Н.

Авторы: Добровольская Т.Г., Якушев А.В., Юрченко Е.Н.
Сборник: "Болота и биосфера" Материалы Всероссийской с международным участием девятой школы молодых ученых. 14-18 сентября 2015
Год издания: 2015
Место издания: ПресСто Иваново
Первая страница: 51
Последняя страница: 55
Аннотация: Введение. Верховые болота в России по площади и запасам торфа преобладают над другими типами болот. Верховые торфяники, обладая высокими запасами жизнеспособной микробной биомассы, характеризуются низкими темпами минерализации торфа. Анализ причин медленной деструкции торфа изложен в коллективной монографии «Функционирование микробных комплексов верховых торфяников – анализ причин медленной деструкции торфа», 2013. Микробные сообщества верховых торфяных почв изучаются как русскими, так и зарубежными исследователями [2,3,4,9,10,11]. Следует обратить внимание, на мало изученную, интересную особенность структуры верховых торфяников, сложившейся в процессе их образования и заключающейся в формировании различных форм микрорельефа – кочек, ровных поверхностей и микропонижений. Если почвоведами описаны и изучены свойства торфа и определена эмиссия углерода из этих форм рельефа, то микробиологи не изучали и не сравнивали таксономический состав микроорганизмов в разных элементах микрорельефа. Поэтому целью нашей работы было изучить численность и физиологическое состояние бактериальных сообществ с учётом микрорельефа верхового торфяника. Объекты и методы. Объектом исследования являлась верховая торфяная остаточно эутрофная почва под сосняком кустарничково-пушицево-сфагновым, являющаяся постоянной пробной площадкой Западно-Двинского лесоболотного стационара Института лесоведения РАН в Тверской области. Степень разложения торфа колеблется от 14 до 16 % в горизонтах 12-50 см, представленных верховым торфом, в переходном древесно-травяном торфе она составляет 46%, в низинном осоковом (100-130 см) – 40%. Посев проводили из образцов сфагнума, его очёса и нижележащих торфянистых горизонтов на глюкозо-пептонно-дрожжеву среду (ГПД). Численность и таксономический состав бактерий сапротрофного блока определяли методом посева на ГПД среду. Для исследования брали 1 г образца и помещали в колбу со 100 мл стерильной воды. Далее для десорбции клеток торфяную суспензию обрабатывали на ультразвуковом диспергаторе Bandelin Sonopuls HD 2070 в течение 2 мин при мощности 50%. Для ингибирования грибов в среду добавляли 50 мг нистатина на 0,5 л среды. По полученным данным определяли численность бактерий, выраженную количеством колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сухой почвы. Основных представителей бактерий выделяли в чистую культуру. Идентификацию выделенных штаммов до рода проводили на основании морфологических, культуральных и хемотаксономических признаков [5,6]. Физиологическое состояние бактерий (метаболическую готовность к росту на полимерах) определяли комплексным структурно-функциональным методом. [8]. Поскольку все процедуры проводят с соблюдением стерильности, то был предусмотрен контроль на стерильность. Гомогенизацию и десорбцию микроорганизмов с твердых субстратов проводят в водной суспензии (1 : 10) в течение 20 мин при 2000 об./мин на встряхивателе “вортэкс” модель “Multi Reax” фирмы “Heidolph”. Крупнодисперсные образцы предварительно измельчают (например, разрезают очёс мха ножницами). Для подавления роста грибов в суспензию вносили антигрибной антибиотик нистатин 0.05%. Избыток частиц субстрата удаляют центрифугированием при 3200 g 5 мин. Концентрацию и состав культивируемых микроорганизмов в исходном субстрате определяют высевом из супернатанта на агаризованную ГПД среду общепринятым способом. Супернатант добавляют по 100 мкл в ячейки 96 - луночной плоскодонной культуральной планшеты с крышкой, в которую уже внесен набор различных жидких питательных сред по 100 мкл. Исследовался гидролитический бактериальный блок, поэтому в качестве органических компонентов жидких сред были использованы следующие полимеры: нуклеиновая кислота, белок казеин и кератин, аналог жиров твин 20, полисахариды декстран, инулин, хитин, карбоксиметилцеллюлолза (КМЦ), ксилан, крахмал, пектин. Хитин, кератин, пектин, казеин, крахмал стерилизовались автоклавированием при 0,5 атм. Остальные субстраты фильтровались через мембранные фильтры, с диаметром пор 0.22 мкм. Чтобы не принять за рост на органическом веществе питательной среды рост за счет побочных веществ инокулируемой суспензии исследуемого образца, необходим контрольный вариант питательной среды без ростового субстрата. Для предотвращения испарения воды из ячеек, планшет с боков закрывают лентой парафилм (parafilm). Планшет помещают в имунноферментный анализатор (ИФА) (например, “Sunrise” фирмы “Tecan”), который автоматически регистрирует рост микроорганизмов по оптической плотности (при 620 нм) в динамике, с периодическим встряхиванием планшеты. Для поддержания температуры прибор помещают в климатическую камеру. Температура была стандартная для выращивания почвенных микроорганизмов - 25°С. На 68 100 и 204 ч роста были сделаны посевы на агаризованную ГПД среду, чтобы выяснить состав ассоциаций, развившихся на полимерах. По данным посева из ячеек строят калибровочное уравнение, позволяющее пересчитать оптическую плотность на концентрацию клеток микроорганизмов. Рост периодической смешанной культуры (ассоциации микроорганизмов) в ячейках описывают комплексной моделью, разработанной для чистой культуры (Якушев, 2015). В данной работе теоретически интерпретировался только участок подготовки микроорганизмов к росту (лаг- фаза) и фаза экспоненциального роста. Математическая модель имеет вид ( ) (1 ) 0 0 t o x t x r r e m     , где x(t)-концентрация клеток (КОЕ/мл) в момент времени t, x0- начальная концентрация клеток, ρ0 – значение функции физиологического состояния растущей культуры в нулевой момент времени, μm-максимальная удельная скорость роста микроорганизмов. В работе метаболическая готовность к росту γ=100+ln(ρ0): чем она больше, тем готовность больше. Результаты исследования и обсуждение. Численность бактерий, определённая методом посева, мало изменялась по профилю почвы, как в кочках, так и в микропонижениях. В кочке плотность бактериальных популяций колебалась в пределах (1.6- 3.8) *106 до глубины 55 см. В микропонижении диапазон колебаний численности бактерий составил 2 *104 в очёсе сфагнума и 9*105 в нижнем горизонте. Таким образом, концентрация бактерий была на 1-2 порядка выше в кочке, чем в микропонижении. Полученные данные коррелируют с выводами, полученными авторами [1] об эмиссии СО2 из разных элементов микрорельефа верхового болота. Было установлено, что ровные поверхности выделяют СО2 в 2 раза, а кочки – в 3 раза больше, чем мочажины, в теплое время года. В холодный период соотношение для ровных поверхностей и мочажин сохраняются, но поток диоксида углерода с кочек в 5 раз больше чем с мочажин (при значительно меньших скоростях эмиссии, чем в теплое время). В составе бактериальных сообществ во всех исследованных образцах из разных элементов микрорельефа доминировали аэробные протеобактерии. Бактерии гидролитического блока были обнаружены в очёсе сфагнума и торфянистых горизонтах. Их доля колебалась от 2 до 20% в кочке и достигала почти 50% в горизонте 3-20 см в микропонижении. Бактерии-гидролитики были представлены бациллами и актиномицетми. Бактериальные сообщества очёса сфагнума в понижении и на кочке, были сравнены комплексным структурно-функциональным методом [8]. Оценка физиологического разнообразия гидролитического бактериального комплекса проводилась по доле сред с полимерами, на которых наблюдался рост при инокуляции суспензией исследуемых образцов (рис.1 (а)). Роста бактериальных ассоциаций из микропонижений не было на трудноразлагаемых полимерах - хитине и целлюлозе, а так же на инулине (запасном углеводе сложноцветных растений) и кератине (животном белке). Полученные данные указывают на потенциальную способность бактериального комплекса из очёса сфагнума кочки гидролизовать более широкий спектр полимеров, чем из микропонижения. На рис.1 (б) приведен пример кривых периодического роста бактериальных ассоциаций на полимерах. По данным посева на 2-3 сутки в гидролитическом ядре ассоциации доминируют флавобактерии, цитофаги, актиномицеты а через неделю преобладают бациллы и актиномицеты. При этом во все сроки наблюдения, помимо гидролитиков, выделяются бактерии, относящиеся к группе копиотрофов и олиготрофов. Если из исходной суспензии очеса при посеве на чашки с ГПД выделялось 8 типов колоний бактерий, то при высеве из этих же суспензий после инкубирования их на 12 средах с полимерами, общее число выделенных типов колоний бактерий увеличилось в 6 раз. На рис.2 (а) представлены результаты определения максимальной удельной скорости роста (μm). На рис. 2 (б) - метаболической готовности к росту ассоциаций на полимерах (γ). Мы полагаем, что доля быстрорастущих ассоциаций отражает долю r-стратегов в бактериальном сообществе очёса. Из рис. 2 (а) следует, что доля быстрорастущих бактерий в сапротрофном бактериальном комплексе выше в кочке, чем в микропонижении. Наша гипотеза состоит в том, что доля метаболически готовых к росту на полимерах ассоциаций отражает действительную способность к потреблению полимеров in situ Из рис. 2 (б), следует что метаболическая готовность к потреблению полимеров выше в сфагнуме на кочке, по сравнению с понижением. Заключение. Таким образом, численность бактерий, определённая методом посева, была на два порядка выше в кочке, чем в микропонижении. В бактериальных сообществах кочек и микропонижений доминируют протеобактерии. Бактерии гидролитического блока представлены бациллами и актиномицетами. При использовании комплексного структурно-функционального метода была установлена потенциальная способность гидролитического комплекса очёса сфагнума кочки гидролизовать более широкий спектр полимеров, чем в понижении. Метаболическая готовность к росту на полимерах и доля быстрорастущих бактерий оказались так же выше в бактериальных комплексах кочки по сравнению с микропонижением. Список литературы 1. Глухова Т.В., Вомперский С.Э., Ковалев А.Г. Годовая эмиссия СО2 олиготрофных болот южнотаёжной зоны ЕТР с учётом микрорельефа // Почвоведение. – 2014. – №1. – С. 48-57. 2. Головченко А.В., Добровольская Т.Г., Звягинцев Д.Г. Микробиологические основы оценки торфяника как профильного почвенного тела //Вестник Томского государственного педагогического университета. – 2008. – № 4 (78). – Серия: Биологические науки. С. 46-53. 3. Головченко А.В., Панкратов Т.А., Добровольская Т.Г., Кухаренко О.С. Торфяные почвы как банк бактериального разнообразия // Труды Института экологического почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова “Роль почв в биосфере”.– 2010. – Выпуск 10. – С. 181-209. 4. Добровольская Т.Г., Головченко А.В. , Кухаренко О.С., Якушев А.В., Семёнова Т.А., Инишева Л.И. Структура микробных сообществ верховых и низинных торфяников Томской области // Почвоведение. – 2012. – № 3. – С. 317-326. 5. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. – М.:МАКС Пресс, 2003. – 120с. 6. Определитель бактерий Берджи. – М.: Мир, 1997. Т. 1, 2. – 800 с. 7. Функционирование микробных комплексов верховых торфяников – анализ причин медленной деструкции торфа. – М.: КМК, 2013. – 128с. 8. Якушев А.В. Комплексный структурно-функциональный метод характеристики микробных популяций //Почвоведение. – 2015. – № 4. – С. 429-446. 9. Martin N.J., Siwasin J., Holding A.J. The bacterial population of a blanket peat // J. Appl. Bacteriol. 1982. V. 53. P. 35–48. 10. Martin N.J., Siwasin J., Holding A.J. The bacterial population of a blanket peat // J. Appl. Bacteriol. 1982. V. 53. P. 35–48. 11. Opelt K., Chobot V., Hadacek F., Schonmann S., Eberl L., Berg G. Investigations of the structure and function of bacterial communities associated with Sphagnum mosses // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. №11. P. 2795–2809. STRUCTURE OF BACTERIAL COMMUNITIES IN DIFFERENT ELEMENTS MICRORELIEF OF PEATBOGS Dobrovol'skaya T.G., Yakushev A.V., Yurchenko E.N. Studied population, the ratio of ecological and trophic groups of bacteria and physiological state of bacterial communities in different elements of the microrelief upland moor. It is found that feathering sphagnum bumps higher number of bacteria and the ability to hydrolyze a broad range of polymers, as compared with microdepressions. Metabolic readiness for growth in polymers and growing proportion of the bacteria appeared just above the bacterial complexes feathered sphagnum on the bumps.
Добавил в систему: Якушев Андрей Владимирович

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИПМех РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИПМех РАН

Структура бактериальных сообществ в разных элементах микрорельефа верхового торфяникастатья

Прикрепленные файлы