Количественный анализ действия клеточных репортеров на основе фьюжен белков люциферазы

Христиченко, А.Ю.; Полозников, А.А.; Хушпульян, Д.М.; Смирнова, Н.А.; Захарянц, А.А.; Казаков, С.В.; Тишков, В.И.; Газарян, И.Г.

Авторы: Христиченко А.Ю., Полозников А.А., Хушпульян Д.М., Смирнова Н.А., Захарянц А.А., Казаков С.В., Тишков В.И., Газарян И.Г.
Журнал: Вестник Московского университета. Серия 2: Химия
Том: 60
Номер: 4
Год издания: 2019
Издательство: Издательский дом МГУ
Местоположение издательства: Москва
Первая страница: 240
Последняя страница: 247
Аннотация: Клеточные репортеры на основе экспрессии слитых белков люциферазы с доменами траскрипционных факторов, ответственных за их стабильность, представляют собой микробиореакторы, позволяющих напрямую следить за судьбой транскрипционного фактора (или его домена), меченого люциферазой, в реальном времени. Для понимания принципиальных возможностей и ограничений данных систем для применения в прикладных и фундаментальных исследованиях необходима разработка количественного описания их действия, которая предполагает расчет/измерение действующих внутриклеточных концентраций слитых белков и скорость их наработки. В данной работе на основе экспериментальных данных была рассчитана внутриклеточная концентрация фьэжен белков люциферазы в стационарном состоянии в линиях нейробластомы SH-SY5Y, стабильно экспрессирующих слитые белки-репортеры HIF1 ODD-luc и Neh2-luc, методом калибрования по люциферазной активности. Показано, что в обоих случаях концентрации слитых белков люциферазы составляют порядка 60-80 нМ, что близко к значениям как константы Михаэлиса (10-100 нМ HIF) для HIF пролил гидроксилазы, так и константы диссоциации комплекса Keap1-Nrf2 (50 нМ), - параметрам, контролирующим скорость-лимитирующие стадии действия HIF1 ODD-luc и Neh2-luc репортеров, соответственно. Новые данные позволяют оценить скорости наработки и максимально достижимую концентрацию фьюжен-белков в условиях их стабилизации. Это позволяет предложить количественную схему действия Neh2-luc репортера для объяснения значительного сдвига кажущихся параметров активации по сравнению с истинными константами диссоциации, определяемыми для известных активаторов «вытеснения» в гомогенном анализе методом поляризации флуоресценции с использованием рекомбинантного Keap1 и меченого Nrf2 пептида. Ключевые слова: Nrf2, Keap1, HIF пролилгидроксилаза, бардоксолон, андрографолид, активаторы вытеснения
Добавил в систему: Тишков Владимир Иванович

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИПМех РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИПМех РАН

Количественный анализ действия клеточных репортеров на основе фьюжен белков люциферазыстатья

Прикрепленные файлы