Влияние последовательности His6 на экспрессию и свойства фенилацетонмонооксигеназы из Thermobifida fuscaстатья
Статья опубликована в журнале из списка RSCI Web of Science
Статья опубликована в журнале из перечня ВАК
Статья опубликована в журнале из списка Web of Science и/или Scopus
Дата последнего поиска статьи во внешних источниках: 7 октября 2020 г.
Аннотация:Фенилацетонмонооксигеназа (КФ 1.14.13.92, РАМО) - фермент, катализирующий реакцию окисления кетонов до сложных эфиров с использованием молекулярного кислорода и NADPH. РАМО является перспективным ферментом для использования в биотехнологических процессах. Нами получены генетические конструкции с геном PAMO из Thermobifida fusca, в который были дополнительно введены нуклеотиды, кодирующие последовательность His6 (His-tag) как на N-, так и на С-конце фермента (PAMO N и PAMO С соответственно). Также была получена описанная ранее PAMO L с His-tag, отделенным от С-конца дополнительным линкером KLGPEQKLISEEDLNSAVD. Все варианты PAMO экспрессировались в клетках E.coli BL21(DE3) в активной форме, однако в случае PAMO N уровень экспрессии по сравнению с таковым для двух остальных форм был в 3-5 раз выше. Каталитические константы kcat PAMO С и PAMO L совпадают с литературными данными для PAMO L, полученной в другой системе экспрессии. В случае PAMO N наблюдается небольшое (на 15%) уменьшение kcat. Константы Михаэлиса по NADPH для всех форм РАМО в пределах погрешности совпадают с литературными данными для PAMO L, а KM по бензилацетону была выше в несколько раз. Изучение кинетики термоинактивации и эксперименты по ДСК показали большую (в 3-4 раза) температурную стабильность PAMO N по сравнению с вариантами фермента с His-tag на С-конце.