Аннотация: В данной работе исследовали продукты модификации ГАФД восстановленным глутатионом (GSH), а также обратимость глутатионилирования.
Показано, что в присутствии 200 мкМ Н2О2 и 200 мкМ GSH ГАФД полностью инактивируется. В отличие от окисления Н2О2 в отсутствие GSH, эта инактивация частично обратима. Следовательно, при окислении Н2О2 в отсутствие и в присутствии GSH образуются разные продукты окисления.
MALDI-масс-спектрометрический анализ ГАФД, окисленной Н2О2 в присутствии GSH, обнаружил дополнительное плечо в спектре ГАФД, соответствующее по молекулярной массе смешанному дисульфиду ГАФД-S-SG, которое исчезало после обработки дитиотреитолом. Анализ масс-спектров трипсинового гидролизата модифицированной ГАФД выявил наличие дисульфидного мостика в пептиде активного центра ГАФД.
Таким образом, в препарате ГАФД, окисленной Н2О2 в присутствии GSH, часть цистеинов активного центра (Цис150) образует смешанный дисульфид ГАФД-SSG, а другая их часть образует дисульфидный мостик с близлежащим Цис154. Анализ обратимости данной модификации ГАФД показал, что 15% активности восстанавливаются в присутствии 5 мМ GSH, что соответствует восстановлению смешанного дисульфида; 70% активности восстанавливается 5 мМ дитиотреитолом, что соответствует восстановлению как смешанного дисульфида, так и дисульфидных мостиков. Следовательно, на долю внутримолекулярного дисульфида приходится около 55% модифицированной ГАФД.
Вероятно, глутатионилированная ГАФД является промежуточным продуктом окисления ГАФД в присутствии GSH. Образование смешанного дисульфида облегчает образование внутримолекулярного дисульфида между Цис150 и Цис154.
Физиологический смысл этой реакции состоит в том, что в отличие от продуктов окисления цистеинов перекисью водорода, образующихся в отсутствие GSH (сульфиновой и сульфоновой кислот), внутримолекулярный мостик легко восстанавливается ДТТ. В клетке эту функцию выполняет тиоредоксин.