|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Особенности кинетики ингибирования циклооксигеназы-1 напроксеномтезисы доклада
- Авторы: Берзова А.П., Бархатов В.И., Митрофанов С.И.
- Сборник: Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2013»
- Редакторы: Андреев А.И., Андриянов Андрей Владимирович, Антипов Евгений Александрович, Чистякова М.В.
- Тезисы
- Год издания: 2013
- Издательство: ООО "МАКС Пресс"
- Местоположение издательства: Москва
- Первая страница: 46
- Последняя страница: 47
- Аннотация: Фермент простагландин-H-синтаза (также называемый циклооксигеназой, далее PGHS) играет важную роль в функционировании организма млекопитающих. Две изоформы (PGHS-1 и PGHS-2) участвуют в поддержании тонуса гладкой мускулатуры, регуляции свёртывания крови, развитии воспаления и других процессах. Фермент существует в виде гомодимера, локализован на мембранах ЭПР и ядра и катализирует две реакции: специфическую – циклооксигеназную и неспецифическую – пероксидазную, причём реакции взаимосвязаны [1,2,3]. Основной интерес к PGHS с точки зрения фармакологии заключается в том, что ингибиторы её циклооксигеназной активности являются нестероидными противовоспалительными препаратами. Ингибиторы обладают разной селективностью по отношению к изоформам фермента, а также различными побочными эффектами. Во времена открытия PGHS различали необратимые (аспирин и производные) [4] и обратимые конкурентные ингибиторы. В дальнейшем было показано, что некоторые обратимые ингибиторы являются времязависимыми, и была предложена кинетическая схема их действия [5,6]. Мы выбрали для исследований напроксен, широко известный как конкурентный ингибитор, для которого не было сведений о времязависимом связывании. Однако в эксперименте было показано обратное. Кинетическая схема, отражающая реакцию в присутствии времязависимого ингибитора, не может быть описана целиком в рамках квазистационарного или квазиравновесного приближения. Мы предположили (и в дальнейшем подтвердили правомерность такого предположения), что характеристическое время достижения квазистационара в реакции с субстратом много меньше, чем время достижения равновесия в реакции с ингибитором. Это позволило разделить схему на два участка: связывание фермента с ингибитором и реакция фермента с субстратом. Связывание фермента и ингибитора после их смешивания можно рассматривать в предстационарном режиме. При последующем добавлении субстрата можно считать, что концентрация фермент-ингибиторного комплекса меняется пренебрежимо мало за время достижения стационарного по субстрату режима, и применять стационарное приближение, учитывая только не связанный с ингибитором фермент. Таким образом, скорость реакции в начальный момент времени после добавления субстрата пропорциональна концентрации активного (свободного от ингибитора) фермента и практически не зависит от концентрации ингибитора. Эксперимент ставился следующим образом. В буферный раствор добавляли PGHS и напроксен и прединкубировали некоторое время. Далее добавляли субстрат (арахидоновую кислоту) и детектировали скорость поглощения кислорода в процессе реакции. Зависимость начальной скорости реакции от времени прединкубации белка с ингибитором мы приблизили согласно рассчитанному в предстационарном режиме уравнению E+I⇄EI (рис.1). По полученным графикам вычислили равновесную при данной концентрации ингибитора концентрацию активного белка. Мы построили зависимость этой концентрации от концентрации ингибитора (рис.2) и показали, что эта зависимость не описывается простейшей схемой ингибирования (R2=0,944), приведенной выше, а также схемой E+I⇄EI⇄E*I, приведённой в работе [5] для ингибиторов индометацина и флурбипрофена. Мы предложили другую схему: EE+I⇄EIE, EIE+I⇄EIEI. Она описала зависимость существенно лучше (R2=0,999). В этом случае равновесная константа связывания первой молекулы ингибитора оказалась равной 54±7 нМ, второй молекулы – 7,2±3,4 мкМ. Скорость реакции с субстратом формы EIE составила 20% ± 3% от скорости для EE (реакция для IEIE отсутствовала). Такая схема описывает аллостерический эффект ингибитора. Эта схема также может описывать случай связывания ферментом одной молекулы ингибитора неконкурентно с низкой константой и одной – конкурентно с более высокой, при значительном различии констант. Для определения того, какой из этих механизмов является правильным, требуются дальнейшие исследования. Рис.1. Зависимость скорости реакции после добавления субстрата от времени прединкубации фермента с напроксеном перед добавлением субстрата. Рис.2. Зависимость равновесной скорости от концентрации напроксена и приближение этой зависимости согласно кинетическим схемам
- Добавил в систему: Митрофанов Сергей Игоревич
Прикрепленные файлы
| № | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
|---|---|---|---|---|---|
| 1. | Сборник тезисов | Lomonosov_2013_Fizika.pdf | 18,9 МБ | 16 февраля 2015 [Mitrofanov] | |
| 2. | Краткий текст | Тезисы | Tezisi_Lomonosov-2013_Physics_Berzova.pdf | 437,0 КБ | 16 февраля 2015 [Mitrofanov] |