ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Объектом исследования являются бактериальные бета-лактамазы ТЕМ типа: фермент бета-лактамаза ТЕМ-1 и ее мутантные формы, содержащие от одной до четырех единичных аминокислотных замен Цель работы: исследование структурных особенностей бактериальных ферментов бета-лактамаз ТЕМ типа и установление влияния точечных мутаций и их комбинаций на изменение структуры, субстратной специфичности, каталитической активности и стабильности данных ферментов Методы работы: анализ информационных литературных источников, биоинформационный анализ, моделирование структуры, расчеты молекулярной динамики, докинг, квантово-механические расчеты, получение рекомбинантных бета-лактамаз методами генной инженерии, изучение каталитической активности и стабильности методами ферментативной кинетики, молекулярно-генетический анализ, полимеразная цепная реакция, гибридизационный анализ ДНК, обратная транскрипция. Результаты работы: проведена систематизация белковых и нуклеотидных последовательностей бета-лактамаз ТЕМ типа; проведен биоинформационный анализ сопутствующих мутаций у данного типа ферментов; построены компьютерные модели белковых глобул бета-лактамазы ТЕМ-1 и ее мутантных форм; на основании квантово-механических расчетов сделаны предположения о возможной стабилизирующей или дестабилизирующей роли некоторых сопутствующих мутаций; разработан открытый информационный ресурс, объединяющий имеющиеся данные по пространственным структурам, аминокислотным последовательностям и номенклатуре данных ферментов; разработаны методы клонирования, экспрессии и очистки рекомбинантных мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа; создана коллекция, состоящая из плазмид, клеток E. coli – штаммов-продуцентов и препаратов гомогенных мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа, имеющих как единичные замены аминокислотных остатков, так и комбинации ключевых и сопутствующих мутаций: изучены каталитические свойства и термостабильность полученных рекомбинантных ферментов; все исследованные сочетания сопутствующих мутаций разделены на три группы: повышающие структурную стабильность ферментов, и нейтральные; показано, что единичные мутации, как ключевые, так и сопутствующие, оказывают разнонаправленное влияние на кинетические свойства и структурную стабильность ферментов; механизм влияния удаленных аминокислотных остатков на структурные элементы белковой глобулы был впервые изучен методом построения сетей внутрибелковых взаимодействий; для изучения бета-лактамаз, продуцируемых клиническими штаммами грамотрицательных бактерий, разработаны методы определения ДНК и РНК бета-лактамаз разных типов; анализ РНК-транскриптов показал, что у мультирезистентных бактерий экспрессируется тлько часть генов бета-лактамаз.