ИСТИНА

Отчет объемом 150 страниц, 49 рисунков, 8 таблиц, 49 источников, 4 приложения. Ключевые слова: фаговый дисплей, скрининг комбинаторных библиотек, гипервариабельный домен, каталитические антитела. Объектом исследования является высокорепрезентативная библиотека генов иммуноглобулинов, которые потенциально могут проявлять амидазную и эстеразную гидролитическую активность. Целью работы является создание фаг-дисплейной библиотеки на основе генов вариабельных фрагментов иммуноглобулинов человека, рандомизация третьего гипервариабельного участка легкой и тяжелой цепи с помощью ПЦР-мутагенеза, разработка и оптимизация системы скрининга, отбор клонов на способность связывать и/или превращать интересующие соединения, характеристика свойств отобранных иммуноглобулинов с применением платформы современной геномики и протеомики, разработка научно-методических материалов для нового раздела лекций по комбинаторной химии и биологии в рамках курса лекция «Химия белка» и «Химия нуклеиновых кислот» для студентов и аспирантов высших научно-образовательных учреждений, соответствующих современным мировым стандартам, а также подготовка и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов. На отчетном этапе были использованы комбинаторные подходы для получения библиотеки генов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов человека. Получена высокорепрезентативная фаг-дисплейная библиотека иммуноглобулинов человека. Библиотека состоит из нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательно вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гибкий серин-глициновый линкер и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, встроенные в ген pIII фаговой частицы. В свою очередь вариабельные домены представляют собой гены зародышевых линий иммуноглобулинов человека. Третий гипервариабельный участок каждого антитела искусственно рандомизирован методом ПЦР. Представительность полученной библиотеки составила 1,2х109 индивидуальных клонов, что является отличным показателем. Была отработана методика скрининга библиотеки на ковалентные ингибиторы сериновых протеаз, полученных на предыдущем отчетном этапе. Для отбора был выбран биотинилированный арил-фосфонат, который обладает рядом преимуществ, таких как высокая реакционная способность по отношению к сериновым гидролазам, удовлетворительная растворимость и стабильность в водных растворах. За время работы на этапе 2 был проведен скрининг фаг-дисплейной библиотеки и отобрано 8 ковалентно-связывающих фосфонат и 7 нековалентно связывающих клонов. Для всех ковалентно-связывающих клонов были проведены кинетические исследования. На основе анализа данных кинетики был выделены наиболее реакционно-способные клоны с кинетической эффективностью равной 2119 М-1мин-1 и 1000 М-1мин-1, что сравнимо с аналогичными данными для бутирилхолинэстеразы. Для всех ковалентно свзывающих клонов были установлены нуклеофильные аминокислотные остатки, участвующие в связывании с молекулой фосфоната методом масс-спектрометрии. Для семи клонов таким остатком является тирозин 33 легкой цепи, и только для одного тирозин 37, также расположенный в легкой цепи антитела. Разработаны научно-методические материалы для разделов в курсах лекций по теме «Химия белка» и «Химия нуклеиновых кислот». Полученные данные, а именно высокорепрезентативная фаг-дисплейная библиотека иммуноглобулинов человека и методика ее получения, а также методика скрининга, могут быть использованы в университетах, институтах, исследовательских центрах и других научно-исследовательских организациях химико-биологического профиля, занимающихся проблемами получения новых биокатализаторов; а также в биотехнологических подразделениях фармацевтических компаний и фирмах-производителях наукоемкой продукции, основным направлением исследований которых является разработка, создание и внедрение препаратов – ингибиторов гидролитической активности. Разработанные научно-методические пособия могут быть использованы в высших учебных заведениях РФ при чтении курсов лекций для студентов и аспирантов по направлениям: «биоорганическая химия», «биотехнология», «молекулярная биология», «медицинская химия», «химия природных соединений», «биохимия», «комбинаторная химия».