ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Разработан новый подход к регуляции каталитических свойств ферментов, используемых в медицинской практике, который основан на образовании ковалентных конъюгатов фермента с разветвленными сополимерами хитозана (хитоПЭГилирование). Эффективность метода хитоПЭГилирования исследовали на примере нового рекомбинантного препарата L-аспарагиназы из Erwinia carotovora (EwA). Данный препарат характеризуется высокой противоопухолевой активностью и является иммунологически отличным от используемых в медицинской практике препаратов аспарагиназы из E. coli, что определяет перспективы его использования в качестве альтернативы при развитии гиперчувствительности к препарату из E. coli. в результате длительного лечения или при индивидуальной непереносимости первичного препарата. Для оптимизации молекулярной архитектуры и состава конъюгатов синтезирован ряд со-полимеров хитозана «щеточной» структуры, а также конъюгаты EwA с этими со-полимерами. Разработан новый эффективный метод определения состава сополимеров и конъюгатов EwA с ПЭГ-хитозаном основанный на ИК-спектроскопии. Данный метод является «безреагентным», позволяет быстро и надежно получать необходимые параметры из анализа единичного ИК спектра в отличие от используемых ранее трудоемких и недостаточно точных методов, основанных на определении свободных аминогрупп полимеров по реакции с TNBS или OPA. Для анализа аспарагиназной активности конъюгатов разработаны новые методы с применением КД-спектроскопии и кондуктометрии, позволяющие проводить высокопроизводительный анализ модифицированных форм аспарагиназы в отличие от используемого ранее метода «прямой неслеризации». Оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов приводит к увеличению каталитической эффективности фермента (kcat/KM) при физиологических условиях в 3–6 раз. Показано, что конъюгирование повышает термостабильность фермента, снижая его константу инактивации в 2 раза. В опытах in vitro показано, что конъюгаты EwA с ПЭГ-хитозаном проявляют более высокую противоопухолевую активность (на 20-40%) по сравнению с нативным ферментом в отношении клеток хронического миелоидного лейкоза человека К562, клеток аденокарциномы молочной железы MCF7, и не приводит к достоверным изменениям в цитостатической активности в отношении клеток лимфомы Беркитта Raji и клеток Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека Jurkat. При этом следует отметить, что удельная активность фермента в конъюгатах в 4-6 раз выше, т.е. при той же дозе (в МЕ) в препарате содержится в 4-6 раз меньше белка, чем в случае нативных ферментов. Полученные результаты открывают перспективы получения аспарагиназных препаратов с улучшенными биокаталитическими свойствами.