ИСТИНА

Оптимизирован метод быстрого определения эффективности действия гентамицина - антибиотика аминогликозидного ряда, на клетки E. coli, экспрессирующие термостабильную люциферазу светляков L. mingrelica. Данная тест-система позволяет в режиме реального времени дифференцированно определять изменение содержания АТР и люциферазы внутри и вне клеток. Для определения люциферазы внутри клеток использовали субстратную смесь на основе люциферина с рН 5.0. При этом значении рН субстрат быстро проникает внутрь клетки и инициирует свечение, а внеклеточная люцифераза инактивируется. Для определения люциферазы вне клеток использовали субстратную смесь на основе люциферина и АТР с рН 7.8, а этих условиях внутриклеточная люцифераза недоступна. Для определения внеклеточного АТР использовали АТР-реагент на основе люциферазы светляков. Для измерения общего АТР клетки лизировали ДМСО и в полученном экстракте определяли АТР с помощью АТР-реагента. Биолюминесценцию регистрировали на люминометре Zulux Corp. (CША) c использованием фильтра с пропусканием 1.25% для снижения светового потока, что позволило варьировать концентрации клеточной суспензии в широком диапазоне. Влияние гентамицина изучали при концентрациях от 0 до 1.6 мг/мл и концентрациях клеток от 20 до 500 млн кл/мл. Инкубировали реакционные смеси в среде LB при 37 °С в аэрированных условиях, а также в условиях ограниченного поступления кислорода для получения кривых роста бактерий в течение 3 часов. Скорость накопления ATPout зависела от концентрации эффектора – в присутствии гентамицина уровень ATPout увеличился до 14 раз в зависимости от его концентрации, в то время как в контрольном эксперименте ATPout вырос в 3 раза. Уровень внеклеточной люциферазы также превышал в 6-8 раз ее уровень в контрольном образце. ATPin в отсутствие антибиотика вырос в 2.5 раза, в то время как в присутствии гентамицина разных концентраций ATPin увеличился в 1.3 - 2 раза. При этом уровень внутриклеточного фермента увеличился в 3.5 раза в контроле, в то время как в гентамицине его уровень практически не менялся – можно предположить, что синтез эндогенной люциферазы клеткой E. coli прекратился. Таким образом, остаточное содержание ATPin в клетках свидетельствует о том, что на начальном этапе действия антибиотика проявляется, скорее, бактериостатический эффект. Полученные результаты могут использованы при разработке новых модифицированных форм антибактериальных агентов при изучении эффективности и механизма их действия.