|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Молекулярное моделирование механизмов ферментативных реакций фосфорилирования-дефосфорилированияНИР
Molecular modeling of mechanisms of enzyme reactions of phosphorylation-dephosphorylation
- Руководитель НИР: Григоренко Б.Л.
- Ответственный исполнитель: Поляков И.В.
- Участники НИР: Капуста Д.П., Книга А.Е., Кулакова А.М.
- Подразделение: Кафедра физической химии
- Срок исполнения: 1 января 2019 г. - 31 декабря 2021 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 19-03-00076
- Номер ЦИТИС: АААА-А19-119011690074-1
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.01.77 Математические и кибернетические методы
-
Ключевые слова:
гистидин-киназа, холинэстеразы, квантовая химия, гуанозинтрифосфат-связывающие белки, км/мм, молекулярное моделирование
guanosinetriphospate-binding proteins, cholinesterases, molecular modeling, histidine-kinase, quantum chemistr, qm/mm -
Описание:
Целью проекта является исследование механизмов реакций фосфорилирования-дефосфорилирования в выбранных для анализа важнейших ферментативных системах с использованием методов молекулярного моделирования, включая методы квантовой химии, квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ), молекулярной динамики с классическими силовыми полями и потенциалами КМ/ММ. Актуальность исследования определяется тем, что процессы переноса остатков фосфорной кислоты между биомолекулами являются одними из самых важных и распространенных в химии природных соединений. Современное компьютерное моделирование биопроцессов позволяет получать надежные данные о качественных аспектах механизмов реакций, оценивать кинетические константы элементарных реакций, определять роль ключевых аминокислотных остатков в активных центрах ферментов и предсказывать оптимальные направления модификации ферментов за счет точечных мутаций. В проекте предполагается исследовать ферментативные системы с разными биологическими функциями, но объединенными схожестью элементарных химических процессов в активных центрах ферментов. Для фермента бутирилхолинэстеразы будут построены молекулярные модели и рассчитаны энергетические профили реакций фосфорилирования и дефосфорилирования, происходящие с ферментом при взаимодействии с фосфорорганическими соединениями и его реактивации. Предполагается распространить имеющийся у участников проекта опыт моделирования процессов в активных центрах холинэстераз на новые задачи. Будет исследован механизм дефосфорилирования гуанозинтрифосфата (ГТФ) в белке Ran, и проверена гипотеза об универсальности механизма реакции гидролиза ГТФ «с ассистирующим глутамином», установленном ранее для другой ГТФазы Ras. Будут построены молекулярные модели и характеризованы реакции фосфорилирования аминокилотного остатка гистидина за счет ферментативного гидролиза аденозитрифосфата в доменах гистидин-киназы, которые входят в двухкомпонентную регуляторную систему, отвечающую за механизм адаптации бактерий.
-
Abstract:
The aim of the project is to study the mechanisms of phosphorylation-dephosphorylation reactions in the most important enzymatic systems selected for analysis using molecular modeling methods, including quantum chemistry, quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM), molecular dynamics with classical force fields and QM/MM potentials. The relevance of the study is determined by the fact that the processes of transfer of inorganic phosphates between biomolecules are one of the most important and common in the chemistry of natural compounds. Modern computer simulation of bioprocesses allows one to obtain reliable data on the qualitative aspects of the reaction mechanisms, to estimate the kinetic constants of elementary reactions, to determine the role of key amino acid residues in the active centers of enzymes, and to predict optimal directions of enzyme modification due to point mutations. Enzymatic systems with different biological functions will be investigated, but they are united by similarity of elementary chemical processes in the active centers of enzymes. For butyrylcholinesterase, molecular models will be constructed and the energy profiles of the phosphorylation and dephosphorylation reactions that occur with butyrylcholinesterase when interacting with organophosphorus compounds and upon reactivation. It is planned to extend the experience of the project participants to modeling processes in active centers of cholinesterases for new tasks. The mechanism of the dephosphorylation of guanosine triphosphate (GTP) in the Ran protein will be investigated, and the hypothesis will be verified of the universality of the glutamine assisted reaction mechanism of GTP hydrolysis established earlier for another Ras GTPase. Molecular models will be constructed and the reactions of phosphorylation of the amino acid residue of histidine by enzymatic hydrolysis of adenositriphosphate in the domains of histidine kinase, that are a part of the two-component regulatory system responsible for the mechanism of bacterial adaptation, will be characterized.
-
Планируемые результаты:
В проекте планируется моделирование реакций ферментативного катализа современными методами квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) и молекулярной динамики как с классическими силовыми полями, так и с потенциалами КМ/ММ. Использование подходов КМ/ММ представляется необходимым приемом, поскольку описание разрывов и образований химических связей требует применения методов квантовой химии для выделенной реакционной части системы. В то же время, необходимо учитывать роль белковой матрицы, конформационные состояния которой можно описывать с помощью классических силовых полей. Применение методов КМ/ММ к моделированию реакций в ферментах описано, например, в недавних обзорах. Участники настоящего проекта разрабатывают способы компьютерной реализации КМ/ММ, а также активно применяют этот подход при решении различных биомолекулярных задач. Например, в работе методами КМ/ММ был впервые характеризован весь цикл химических реакций в процессе автокаталитического формирования хромофора зеленого флуоресцентного белка. Важно отметить, что при этом можно получать не только качественные заключения о механизме элементарных химических реакций в активных центрах ферментов, но и оценивать кинетические константы в рамках теории переходного состояния, которые могут быть использованы для численного решения системы дифференциальных уравнений для многостадийных ферментативных процессов. Помимо расчетов энергетических профилей для элементарных химических реакций в активных центрах ферментов, которые проводятся методом КМ/ММ, для описания ферментативных систем необходимы молекулярно-динамические (МД) расчеты, позволяющие учесть многообразие конформационных состояний белковых макромолекул. В настоящее время моделирование конформационной динамики ферментов проводится как традиционными способами с использованием классических силовых полей, так и методами КМ/ММ МД. В последнем случае энергии и силы, действующие на атомы, вычисляются с потенциалами, рассчитываемыми в приближении КМ/ММ.
-
Научный задел:
Участники проекта имеют опыт исследований по тематике проекта, подтвержденный публикациями, включающими более 15 статей и обзоров в журналах из первого Q1 и второго Q2 квартиля за 2013-2018 гг (см. пункт «Публикации участников коллектива за последние 5 лет»). Участники проекта имеют в распоряжении все компьютерные программы, перечисленные в пункте «Предлагаемые подходы и методы», установленные и функционирующие на суперкомпьютерных центрах Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, на Межведомственном суперкомпьютерном центре РАН, на собственных вычислительных кластерах. Участники проекта имеют опыт использования всех перечисленных программ, а также опыт разработки компьютерных программ, реализующих современные алгоритмы молекулярного моделирования. Коллектив участников проекта включает двух опытных специалистов – руководителя проекта д.ф.-м.н. Б.Л. Григоренко (H-индекс равен 27 по данным Web of Science на август 2018) и к.ф.-м.н. И.В. Полякова, аспирантов и студентов МГУ.
-
Основные результаты:
Первый год проекта. По результатам молекулярного моделирования будет сформулированы механизмы реакций фосфорилирования и реактивации нативной бутирилхолинэстеразы. Второй год проекта. Будет предложен набор точечных мутаций для модифицированного варианта бутирилхолинэстеразы, способного к самореактивации. Будут исследован механизм реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке Ran. Третий год проекта. Будут построены молекулярные модели белок-белковых комплексов для двухкомпонентных регуляторных систем на основе гистидин-киназы EnvZ. По результатам молекулярного моделирования будет исследован механизм реакции фосфорилирования в двухдоменном комплексе НАМР·СА гистидин-киназы EnvZ.
- Добавил в систему: Григоренко Белла Людвиговна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Молекулярное моделирование механизмов ферментативных реакций фосфорилирования-дефосфорилирования |
| Результаты этапа: В полном соответствии с объявленными ранее целями на первый год проекта (2019 г.) методами молекулярного моделирования исследованы две системы, для которых важны реакции фосфорилирования/дефосфорилирования в активном центре фермента. В первом случае целью работы является моделирование взаимодействия бутирилхолинэстеразы (BChE) человека с фосфорорганическими соединениями и моделирование реакции реактивации ингибированного фермента для нативного белка и мутантов. Известны многочисленные попытки синтезировать мутанты BChE, способные эффективно осуществлять разрыв связи фосфор-кислород в отравленном ферменте, восстанавливая боковую цепь каталитического остатка Ser198. В настоящем проекте на основании компьютерных расчетов предложен принципиально новый вариант белка (двойной мутант Asn322Glu/Glu325Gly) с измененной каталитической триадой Ser198-His438-Glu322, что позволяет сблизить боковые цепи His438 и Ser198 и способствовать реакциям с участием Ser198. Расчеты показывают перспективность данного двойного мутанта. Проведена экспериментальная проверка предсказаний компьютерного моделирования и показано, что фермент с новой каталитической триадой должен функционировать. Во втором случае исследована реакция гидролиза гуанозинтрифосфата (GTP) ферментом Ras в комплексе с белком-ускорителем GAP. Результатом реакции является отщепление γ-фосфатной группы от GTP с образованием гуанозиндифосфата и неорганического фосфата. По результатам расчетов методами квантовой механики/молекулярной механики показано, что при теоретическом описании данной ферментативной реакции могут реализовываться разные сценарии, но наилучшее согласие с экспериментальными данными получено для механизма «с ассистирующим глутамином», т.е. с учетом непосредственного участия в реакции боковой цепи Gln61. | ||
| 2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Молекулярное моделирование механизмов ферментативных реакций фосфорилирования-дефосфорилирования |
| Результаты этапа: В соответствии с объявленными целями на второй год проекта (2020 г.) методами молекулярного моделирования исследованы системы, для которых важны реакции фосфорилирования/дефосфорилирования в активном центре фермента. Как и было запланировано в исходной заявке, изучалась реакция гидролиза гуанозинтрифосфата (GTP), катализируемая GTP-связывающим ферментом Ran в комплексе с его активирующим белком RanGAP. В отличие от рассмотренной на первом этапе проекта реакции гидролиза GTP в другом ферменте Ras-RasGAP, катализ в системе Ran-RanGAP имеет ряд особенностей. Прежде всего, ускоритель RanGAP не предоставляет в активный центр Ran аминокислотный остаток аргинина, что является отличительной чертой большинства систем типа Ras-RasGAP. Кроме того, в системе присутствует еще один белковый домен. На основе кристаллографических данных методами молекулярного моделирования построена трехдоменная система, изучена ее динамика, определены структуры стационарных точек на поверхности потенциальной энергии и рассчитан профиль энергии Гиббса вдоль координаты реакции. Использованы методы молекулярной динамики с классическими силовыми полями, а также с потенциалами метода квантовой механики/молекулярной механики. Показано, что каталитический механизм без участия аргинина от RanGAP имеет общие черты с механизмом «с ассистирующим глутамином», как и в Ras-RasGAP. Важность результатов моделирования связана с тем, что Ran регулирует нуклео-цитоплазматический транспорт, и нарушение экспрессии Ran имеет отношение к развитию онкологических заболеваний. Вторая часть работ по проекту – моделирование комплекса РНК-полимеразы вируса SARS-CoV-2 с фавипиравиром. Пандемия COVID-19 стимулировала активное изучение молекулярных процессов, протекающих во всех компонентах вируса SARS-CoV-2, включая важнейший его участок – РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), ответственную за репликацию и транскрипцию генетической информации. Потенциальные ингибиторы RdRp рассматриваются как перспективные лекарственные препараты лечения болезни, и одним из наиболее интересных кандидатов является фавипиравир. В работе методами молекулярного моделирования построена модель активного центра РНК-полимеразы с включенной молекулой фавипиравира. Анализ полученной структуры показывает, что фавипиравир в форме рибозатрифосфата может встраиваться в комплекс nsp12-nsp7-nsp8 с цепочками РНК и конкурировать с природными нуклеотидами в реакции наращивания цепи. Структура активного центра фермента позволяет объяснить катализируемую ферментом реакцию разрыва связи фосфор-кислород в молекуле ингибитора. | ||
| 3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Молекулярное моделирование механизмов ферментативных реакций фосфорилирования-дефосфорилирования |
| Результаты этапа: В полном соответствии с объявленными в заявке целями и задачами Проекта выполнены следующие исследования, результаты которых опубликованы в авторитетных научных журналах. Методами молекулярного моделирования исследованы следующие системы, для которых важна реакция дефосфорилирования в активном центре фермента. В первом случае целью работы является моделирование реактивации бутирилхолинэстеразы (BChE) человека, ингибированной фосфорорганическими соединениями (ФОС). Известны многочисленные попытки синтезировать мутанты BChE, способные эффективно осуществлять разрыв связи фосфор-кислород в отравленном ферменте, восстанавливая боковую цепь каталитического остатка Ser198. На основании компьютерных расчетов предложен принципиально новый вариант белка (двойной мутант Asn322Glu/Glu325Gly) с измененной каталитической триадой Ser198-His438-Glu322, что позволяет сблизить боковые цепи His438 и Ser198 и способствовать реакциям фосфорилирования/дефосфорилирования с участием Ser198. Проведена экспериментальная проверка предсказаний компьютерного моделирования и показано, что фермент с новой каталитической триадой должен функционировать. Рассчитанный методом квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) энергетический профиль пути реакции согласуется с возможностью такой реакции. При помощи молекулярно-динамических расчетов с КМ/ММ-потенциалами исследованы пути переноса протона и определено протонированное состояние глутаминовых кислот активного сайта двойного мутанта. Методами классической молекулярной динамики исследованы возможные пути повышения его конформационной стабильности. Вторая часть работ по проекту – моделирование комплекса РНК-полимеразы вируса SARS-CoV-2 с фавипиравиром. Пандемия COVID-19 стимулировала активное изучение молекулярных процессов, протекающих во всех компонентах вируса SARS-CoV-2, включая важнейший его участок – РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), ответственную за репликацию и транскрипцию генетической информации. Потенциальные ингибиторы RdRp рассматриваются как перспективные лекарственные препараты лечения болезни, и одним из наиболее интересных кандидатов является фавипиравир. В работе методами молекулярного моделирования построена модель активного центра РНК-полимеразы с включенной молекулой фавипиравира. Анализ полученной структуры показывает, что фавипиравир в форме рибоза трифосфата может встраиваться в комплекс nsp12-nsp7-nsp8 с цепочками РНК и конкурировать с природными нуклеотидами в реакции наращивания цепи. Структура активного центра фермента позволяет объяснить катализируемую ферментом реакцию разрыва связи фосфор-кислород в молекуле ингибитора. Третью группу работ представляют исследования реакции гидролиза гуанозинтрифосфата (GTP) гуанозинтрифосфат-связывающими ферментами (ГТФазами) Ras и Ran в комплексах с белками-ускорителями (RasGAP и RanGAP). Результатом реакции является отщепление γ-фосфатной группы от GTP с образованием гуанозиндифосфата и неорганического фосфата. По результатам расчетов методами квантовой механики/молекулярной механики показано, что при теоретическом описании данной ферментативной реакции могут реализовываться разные сценарии, но наилучшее согласие с экспериментальными данными получено для механизма «с ассистирующим глутамином», т.е. при непосредственном участии в реакции боковой цепи аминокислотного остатка глутамина - Gln61 (Ras) или Gln71 (Ran). В отличие от активно исследуемой реакции гидролиза GTP в системе Ras-RasGAP, катализ в комплексе Ran-RanGAP имеет ряд особенностей. Прежде всего, ускоритель RanGAP не предоставляет в активный центр Ran аминокислотный остаток аргинина, что является отличительной чертой большинства систем типа Ras-RasGAP. Кроме того, в системе присутствует еще один белковый домен. На основе кристаллографических данных методами молекулярного моделирования построена трехдоменная система, изучена ее динамика, определены структуры стационарных точек на поверхности потенциальной энергии и рассчитан профиль энергии Гиббса вдоль координаты реакции. Использованы методы молекулярной динамики с классическими силовыми полями, а также с потенциалами метода квантовой механики/молекулярной механики. Показано, что каталитический механизм без участия аргинина от RanGAP также относится к механизму «с ассистирующим глутамином», как и механизм в системе Ras-RasGAP. Важность результатов моделирования связана с тем, что Ran регулирует нуклео-цитоплазматический транспорт, и нарушение экспрессии Ran имеет отношение к развитию онкологических заболеваний. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".