![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Создать рабочую методику для определения видов растений в древних образцах растительного происхождения или же содержащих растительные компоненты и получить конкретные результаты по определению таксономического положения растений для реальных образцов (археологические находки, исторический гербарий).
Molecular biology techniques have been used to study DNA recovered from archaeological, paleontological remains, biological material preserved for a long time. The age of successfully investigated finds could be 560-780 thousand years (Middle Pleistocene). The number of publications, both scientific and popular science, clearly show that in the study of ancient samples, researchers principally focused on archaeo- and paleo-samples of animal origin, including humans. This is mainly due to the fact that animal remains are better preserved. In addition, the public is more interested in the results of investigation of human and animal remains than in plants. As a result, the methodology for studying animal samples has been developed much better, and significantly more findings for them have been obtained that attract the attention of the general public. Archeological plant finds remain “in the shadows” of animal finds, despite their periodically declared significance for the studies of the processes of domestication, of the distribution of cultivated plants around the world and of the peculiarities of people's life in previous centuries. The aim of this project is creating the method, based on technologies of high-throughput sequencing, for the taxonomically identification of plants (plant remains) in archaeological findings. As a result of the project, the following samples will be analyzed: (1) Historical herbarium, collected in the 16th century (the results of sequencing of the genetic material from these samples will be used for comparison with the modern specimens of the same species to evaluation of their variability); (2) Archives of the herbarium of Lomonosov Moscow State University. The part of specimens collected by expeditions in tropical countries 60 years ago and more are still haven't identified due to the lack of necessary morphological traits (therefore they are unusable for scientists); (3) Archaeological findings of plant (plant remains) obtained at archaeological sites during the washing of cultural layers as well as finds from “dry” cultural layers of the 8th – 14th centuries (from different territories of the Russian Federation: Kostroma Region, Nizhny Novgorod Region, Kursk Region and other).
Разработанный метод будет использован для определения систематического положения растений из гербарных фондов Московского Университета (https://plant.depo.msu.ru/), а также для определения видовой принадлежности археологических находок растительного происхождения. Гербарий Московского университета - самый старый из ныне существующих гербариев России. В общей сложности, в фондах Гербария МГУ имеется 1 045 000 образцов, в т.ч. не менее 56 000 образцов, собранных до начала 19 века. Самая старая коллекция, имеющаяся в фондах, датирована концом 16 века и была собрана в Италии через несколько лет после изобретения самого принципа гербарной техники. Коллекции 17-го и 18-го века представлены в фондах небольшими разрозненными коллекциями, поступившими из разных источников, хотя также не имеют точной привязки по времени сбора. Исключительно полно представлены в коллекциях Эрхарта и Гофмана сборы конца 18-го и начала 19-го веков. Последующие многочисленные сборы 19 и 20 веков надежно датированы - на них как минимум указан год сбора. Сравнение строения нуклеотидных последовательностей одних и тех же видов, собранных в разные временные промежутки позволит оценить степень изменчивости участков геномов, которые сейчас активно используют для видовой идентификации растений и понять, насколько их можно использовать для растительных образцов, остатки которых датируются более внушительным возрастом. В дополнении к этому будут установлены структуры маркерных нуклеотидных последовательностей типовых образцов ряда видов растений, которые хранятся в гербарном фонде Московского Университета. Такие данные всегда востребованы специалистами, занимающимися филогенией и систематикой различных групп растений. Дополнительным практическим выходом при выполнении этого проекта будет видовая идентификация образцов растений из тех же гербарных фондов, собранных менее 100 лет тому назад, но не подлежащих определению из-за плохого качества образца.Многие тропические образцы в результате сложных для коллекционирования климатических условий (высокая температура, 100-процентная влажность, стремительное развитие плесени) имеют высокую степень деградации растительной ДНК и нуждаются в применении методик, сходных с методиками работы с древней ДНК. Сходные проблемы с разрушением ДНК при сушке образцов имеются среди многочисленных сборов из Средней Азии, где коллекторы часто высушивали гербарные экземпляры на открытом солнце. ДНК-штрихкодирование таких неопределенных образцов с последующей идентификацией позволит ввести их в активный научный оборот и позволит активно работать над филогенетикой многих широко здесь представленных групп. Определение видовой принадлежности образцов семян (карбонизированных и некарбонизированных) и плодов из археологических коллекций (возраст семян - 400-1500 лет), полученных при промывке (флотации) культурных слоев при раскопках городища Унорож Костромской обл., а также при раскопках, проводимых рядом с Городцом (Нижегородская обл.), Смоленском и в Смоленской области, Казанью (Древний Болгар), в Московской области, а также археологических находок из “сухих” культурных слоев VIII–XIV вв. (обгорелые зерна, отдельные угли из объектов) могут внести вклад в реконструкцию пищевого рациона людей прошлого, определить возможные ареалы видов растений, пути их расселения. При хороших результатах исследований возможно привлечение материала, найденного при археологических раскопках в Самарской луке и на Старой Ладоге.
Участники рабочего коллектива имеют опыт по всем планируемым направлениям исследований и доступ ко всему необходимому для проведения проекта оборудованию. А.С. Сперанская, А.А. Криницына имеют большой опыт в проведении работ, относящихся к молекулярно-биологическим исследованиям, владеют необходимыми навыками для проведения работ по выделению ДНК как из гербарных образцов, так и из растительных смесей, которые подвергались измельчению и тепловой обработке, постановке ПЦР (в т.ч. ПЦР в реальном времени), созданию ДНК-библиотек для секвенирования с использованием различных платформ.Они выступали в качестве исполнителей в проекте по разработке методик для анализа видового состава пищевой продукции растительного происхождения с помощью высокопроизводительного секвенирования (МОН РФ, проект № 14.609.21.0101), успешно завершенного в 2019 году, где, в частности, получили опыт работы с выделением, секвенированием высоко деградированной ДНК растений из сильно измельченных и термически обработанных образцов растительного происхождения, содержащих большое количество жиров или вторичных метаболитов (травяные смеси, кофе). А.Е. Самойлов имеет большой опыт в создании биоинформатических пайп-лайнов и обработке данных высокопроизводительного секвенированияя, в том числе и с многокомпонентными образцами. А.П. Серегин , как сотрудник гербария Московского Университета, обладает бесценным опытом работы с гербарными образцами. Е.Г. Ершова и В.В. Енуков имеют огромный опыт в направлении работ, связанных с археологическими изысканиями. Е.Г Ершова является специалистом в определении спорово-пыльцевого спектра. В.В. Енуков имеет огромный опыт по проведению археологических исследований, связанных с изучением археологических памятников IX–XIV вв. На использование образцов из археологических коллекций получено согласие от археологов Института археологии РАН, нижегородской археологической экспедиции, Казанского университета. Возможно сотрудничество с ИИМК РАН, Самарским музеем.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 апреля 2021 г.-15 февраля 2022 г. | Древняя ДНК растений: баркодинг неидентифированых образцов исторического фонда Гербария МГУ и археологических находок растительного происхождения из Средней России |
Результаты этапа: При анализе препаратов ДНК, которые были получены из гербарных образцов, собранных во Вьетнаме в 2015 году, было показано, что во всех образцах ДНК присутствуют фрагменты, длина которых находится в диапазоне 70-800 п.н. При этом во всех образцах отмечали наличие фракции длинных фрагментов, около 2,5-3 тысяч п.н., хотя доля таких фрагментов в образцах была не высока. При оценке длин фрагментов ДНК, полученной из образцов гербария 1989 года и более старых (гербарий видов сем. Solanaceae) было выявлено, что у основная доля фрагментов ДНК приходилась на низкомолекулярную фракцию: у 62% образцов, которые находились в гербарных фондах около 30 лет, длины фрагментов не превышали 500 п.н., у остальных длины фрагментов не превышали 300 п.н. У 27% образцов из обеих групп, дополнительно присутствовали длинные фрагменты ДНК (средняя длина фрагментов в этой фракции составляла 2,5-2,8 тысяч п.н.) Однако, их концентрация была незначительна. Средняя длина фрагментов ДНК, полученных из образцов, собранных на Филиппинах и хранившихся в гербарных фондах около 185 лет, находилась в диапазоне 15-150 п.н. При этом в 38% таких образцов присутствовали фрагменты ДНК длиной около 2,5 тыс. п.н. Получение продукта амплификации протяженных участков ДНК (маркерных последовательностей, которые возможно использовать для бакродирования) увенчалось успехом для 71% образцов, срок хранения в гербарных фондах составлял 30 и менее лет. Для образцов, срок хранения которых приближался к 185 годам, получить при амплификации участков ДНК, которые соответствовали участку ядерной ДНК ITS1 и ITS2 удалось только для 48% образцов, тогда как участок гена хлоропластов (rbcL) удалось наработать только у 14% образцов. Полученные ампликоны были отсеквенированы (для каждого образца секвенировали смесь ампликонов, всего секвенировали 59 образцов) и сейчас проводится их сборка и анализ с использованием базы данных NCBI. Эти данные готовятся для загрузки в базу данных NCBI в соответствующий BioProject. Опробованные протоколы обогащения образца фрагментом ITS1 показали положительный результат (был получен продукт амплификации) для всех образцов, которые были взяты в работу и для которых наработка более длинных фрагментов традиционным способом была неудачной. После анализа фрагментов ДНК гербарных образцов 2015 и 1989 годов сбора (Вьетнам) с использованием базы данных NCBI удалось установить таксономическую принадлежность 28 образцов из проанализированных 45. Год сбора, образец, род, семейство 2015, MW0755668, Duperrea sp., Rubiaceae 2015, MW0755669, Impatiens sp., Balsaminaceae 2015, MW0755676, Ophiorrhiza sp., Rubiaceae 2015, MW0755677, Stauranthera, Gesneriaceae 2015, MW0755680, Marsdenia sp., Apocinaceae 1989, MW0753181, MW0753180, Vernonia sp., (Decaneuropsis sp.), Asteraceae 1989, MW0753179, Capparis sp., Capparaceae 1989, MW0753177, Saraca sp., Fabaceae 1989, MW0753176, Aglaia sp., Meliaceae 1989, MW0753173, Beilschmiedia sp., Lauraceae 1989, MW0753170, Mitragyna sp., Rubiaceae 1989, MW0753162, Maesa sp., Primulaceae 1989, MW0753158, Kadsura sp./ Schisandra sp., Schisandraceae 1989, MW0753157, Hypserpa, Menispermaceae 1989, MW0753153, Prasoxylon sp. / Astrotrichilia sp., Meliaceae 1989, MW0753147, Dalbergia sp., Fabaceae 1989, MW0753146, Cratoxylum sp., Hypericaceae 1989, MW0753145, Aporosa sp., Phyllanthaceae 1989, MW0753144, Symplocos sp., Symplocaceae 1989, MW0753141, Canarium sp., Burseraceae 1989, MW0753139, Croton sp., Euphorbiaceae 1989, MW0753138, Tecomella sp., Bignoniaceae 1989, MW0753136, Claoxylon sp., Euphorbiaceae 1989, MW0753135, Salacia sp., Celastraceae 1989, MW0753134, Tabernaemontana sp., Apocynaceae 1989, MW0753133, Claoxylon sp., Euphorbiaceae 1989, MW0753132, Piper sp., Piperaceae 1989, MW0753131, Viburnum sp., Adoxaceae После того, как были проведена молекулярно-биологическая часть исследования, проведение сопоставления морфологических признаков, характерных для строения листовых пластинок определенных гербарных образцов, показало, что фрагменты растений, заложенных в гербарий имеют сходные морфологические признаки с представителями этого рода. Оценивали форму размер листовой пластинки, жилкование, листорасположение. При верификации нескольких образцов были получены противоречивые данные, которые не позволяли однозначно трактовать систематическое положение растений. Анализ результатов секвенирования библиотеки, обогащенной целевым фрагментом ITS1, образца MW0755678 показал, что данный сбор с высокой долей вероятности, является образцом нового, еще не описанного вида, относящегося к сем. Acanthaceae. После биоинформатической обработки данных секвенирования обогащенной библиотеки было собрано 17 контигов (длина максимального собранного контига – 165 п.н, минимального – 65 п.н.), с покрытием больше 23х. При сравнении их с данными из базы данных NCBI было показано, что половина из них на 88,46 - 97,18 % идентичны последовательности ITS1 Spathacanthus hoffmannii [AF289802.1], 4 контига на 92,37-98,7% сходны с ITS1 Justicia prominens [KY632590.1], 3 контига на 92 – 93,5% ITS1 Pseuderanthemum tunicatum [MW464271.1]. Единичные контиги оказались на 94,63% идентичными ITS1 Chamaeranthemum gaudichaudii [MW464275.1] и на 93,62% - Schaueria malifolia [KJ535212.1]. Данные полногеномного секвенирования этого образца дополнили полученный результат секвенирования обогащенных библиотек данными о длинных пластомных последовательностях (всего было собрано 3839 контигов, N50 = 741, максимальная длина собранного контига – 41560 п.н.). После выравнивания на базу данных nt с помощью blastn, таксономия полученных последовательностей была получена с помощью MEGAN6 методом LCA. Оказалось, что участок хлоропластного генома на 98% сходен с пластомами Pseuderanthemum haikangense, Clinacanthus nutans и Justicia flava. Дополнительно, были просеквенированы геномные библиотеки еще трех видов этого семейства (Acanthaceae), в результате биоинформатической обработки и сборки данных были получены длинные прочтения хлоропластных геномов: для 6(3) g_6 5 (3081 штука, N50 = 903, макс. длина = 19110), для образца Ac3 r g_1 (6450 штук, N50 = 691, макс. длина = 33374), и для Ac1 r g_2 (5781 штука, N50 = 685, макс. длина = 26224). Полученные контиги также были выровнены на базу данных nt с помощью blastn, таксономия полученных последовательностей была получена с помощью MEGAN6 методом LCA. И эти геномные сборки оказались на 95-99% идентичные последовательностям пластомов рода Justicia. Исходя из полученных данных секвенирования на сегодняшний день нами было принято решение продолжить работы, связанные с уточнением таксономической принадлежности этого образца с привлечением специалистов, занимающихся данной группой растений. В результате секвенирования обогащенной библиотеки для образца (MW0753166), были собраны 6 контигов длиной от 71 до 243 п.н., с минимальным покрытием 15,3х, участка ядерного генома ITS1. Максимальным оказалось покрытие для самой длинной собранной последовательности (9831х). При сравнении полученных последовательностей с данными базы данных NCBI было показано, что все они сходны с последовательностями ITS1 видов рода Derris. Оценка верности определения по морфологическим признакам показала, что этот сбор действительно может принадлежать какому-либо виду, относящемуся к роду Derris. В целом, можно сказать, что предложенный нами метод обогащения библиотек целевыми фрагментами действительно помогает получать данные, позволяющие уточнить систематическое положение. Более точно мы сможем сделать вывод об эффективности методики после попарного сравнения данных секвенирования полногеномных библиотек и библиотек, полученных по протоколу с применением анкерной пцр (для одного и того же образца). Точность определения может зависеть, в том числе, и от наполненности баз данных, с которыми проводится сравнение получаемых в процессе работы последовательностей. При этом использование ограниченного числа маркерных последовательностей упрощает биоинформатическую обработку получаемых данных секвенирования, при этом не снижая эффективность определения образца. При проведении оценки стоимости расходных материалов (реактивов, пластика, расходных материалов) по ценам на март 2022 года (по курсу 1 доллар – 85 рублей) (файл в приложении) стоимость секвенирования одного образца, с использованием обогащенных библиотек (по 1 маркерной последовательности) находится в районе 18,5 тыс рублей. При дополнении образца другими последовательностями, стоимость незначительно увеличивается. Если будет проводится обогащение 2 маркерными последовательностями, то стоимость секвенирования 1 образца увеличится на 280 рублей, если обогащение будет проводится 3 маркерными последовательностями – на 520 рублей (увеличится стоимость реакционных смесей и праймеров для проведения обогащения). Поскольку количество информации, которое возможно получить на 1 обогащенный образец более чем достаточно для того, чтобы определить необходимую последовательность с глубиной чтения не менее 30х, то стоимость самого секвенирования практически не изменится. Кроме того, необходимо отметить, что для секвенирования обогащенных библиотек необходимо соблюдение правила: при секвенировании обогащенных однотипным материалом образцов их доля в общем количестве ДНК не должна превышать 30%. Соответственно, при секвенировании подобных образцов с использованием тех же сиквенсовых реактивов возможно дополнительно проанализировать до 10-15 геномных библиотек. Стоимость секвенирования одного полногеномного образца (при условии, что с использованием 1 чипа и 1 набора секвенирования будет проводиться анализ 48 образцов) оказывается примерно в 1,5 раза выше и составляет около 31 тыс. руб. Трудозатраты на биоинформатический анализ получаемых данных секвенирования обоих вариантов примерно одинаковы, поскольку требуют разных подходов при работе с полученным материалом. Для определения систематической принадлежности образцов с использованием однотипного материала проводится с использованием специализированных баз данных, которые, как правило создаются под определенные проекты и требуют значительных трудозатрат. При этом мы гарантированно получаем данные о строении интересующих нас участков геномов. С другой стороны, анализ полногеномных образцов позволяет, при желании, получить более разнообразную информацию, в том числе и о тех участках генома, для которых не проводили обогащение, не затрачивая на это дополнительных средств для проведения секвенирования. Однако, работа с образцами, в которых ДНК сильно деградировала и размер самых длинных фрагментов не превышает 150 п.н. (а в случае с образцами, которые находят при проведении археологических раскопок фрагменты ДНК не более 20 п.н.) скорее всего окажется более успешной именно при применении протоколов, позволяющих провести обогащение целевыми последовательностями. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".