![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Выяснение принципов функционирования живых систем требует тесной интеграции молекулярных подходов, в том числе методов геномики и протеомики, с детальным количественным анализом структурной организации клеток и субклеточных компартментов с целью максимально точного картирования биомолекул различной природы и определения механизмов биогенеза клеточных структур. Практические аспекты данного рода исследований определяются тем, что понимание структурной организации и динамики клеточных структур имеет огромное значение в биомедицинских исследованиях, способствуя развитию новых технологий диагностики и лечения заболеваний различной природы. Целью настоящего исследования, таким образом, является комплексное исследование субклеточной организации клеток эукариот в норме и при патологии и разработка новых методических подходов для мультимодального микроскопического анализа клеточных структур. Работа направлена на выяснение принципов молекулярной и надмолекулярной организации клеток высших эукариот, что остается одной из наиболее актуальных проблем современной биологии. Исследования в этой области чрезвычайно активизировались в последние годы, что объясняется несколькими причинами. С одной стороны, успехи протеомики и геномики, разработка новых методов молекулярно-биологического и микроскопического анализа позволяют более глубоко изучать клетку , ее органеллы. С другой стороны, медицина, биотехнология и нанотехнологии требуют все более точного описания клеточной организации, что необходимо для разработки новых лекарств, материалов, технологий. Таким образом, на данном этапе развития науки появилась возможность и осознана необходимость широкого изучения самых общих принципов организации клетки эукариот.Выяснение таких принципов является темой настоящей работы.
The work is aimed at clarifying the principles of molecular and supramolecular organization of cells of higher eukaryotes, which remains one of the most urgent problems of modern biology. Research in this area is extremely active in recent years, due to several reasons. On the one hand, advances in proteomics and genomics, development of new methods of molecular-biological and microscopic analysis allows to study more deeply the cell and its organelles. On the other hand, medicine, biotechnology and nanotechnology require a more accurate description of the organization of the cell, it is necessary to develop new drugs, materials, technologies. Thus, at this stage of development of science has emerged an opportunityand matured the demand for a broad study of the most common principles of eukaryotic cell organization.Elucidation of such principles is the subject of this study.
1) Будет проведен систематический поиск веществ, обладающих анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом. Будут созданы экспериментальные модели in vitro, в которых вещества, обладающие анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом будут действовать синергично и будут исседованы механизмы синергетического эффекта. 2) Будет проведен анализ взаимодействия микротрубочек с фокальными контактами и исследована динамика образования и разборки фокальных контактов на примере клеток, трансфецированных «ранними» и «поздними» (винкулин) белками фокальных контактов. 3) Будут исследованы особенности белкового состава и кинетики сборки порового комплекса в клетках, экспрессирующих прогерин в процессе нормального старения. Будут использованы иммунофлуоресцентный анализ для исследования локализации белков-нуклеопоринов и будут сконструированы конструкции, кодирующие белки, связанные с GFP. 4) Будет изучен процесс сегрегации компонентов проядрышек с использованием метода анализа молекулярных взаимодействия FRET, а так же изучение роли GAR-домена фибрилларина в специфическом накоплении белка в сегрегировавших компонентах интерфазных проядрышек.
Данное направление исследований развивалось в НИИ ФХБ с момента его основания в 1965 году. Основные интерезы научных групп, участвующих в разработке тематики, сосредоточено на морфофункциональных исследованиях клеточного ядра, систем цитоскелета и структуры и функуии митохондрий в норме и патологии. Были разработаны оригинальные методики исследований, включавшие в первую очередь методы мультимодальной мультимасштабной микроскопии, в том числе корреляционные подходы. Были получены важные данные в пользу модели иерархической укладки ДНК в составе интерфазных и митотических хромосом и исследована роль архитектурных белков хроматина в реконструкции высших уровней компактизации ДНК после репликации. Были исследованы динамические свойства микротрубочек как важного фактора регуляции барьерной функции эндотелия и дифференциальная роль подсистем актинового цитоскелета, сформированного бета- и гамма-изоформати актина, в цитоплазматических и дерных процессах. Была исследована роль ядерной ламины в регуляции механических свойств ядра и влияние мутантных форм ламина А на пространственную организацию хроматина в ядре.
1) Анализ расположения слитого с GFP белка - нуклеопорина POM-121 в составе ядерной оболочки при транзитной трансфекции клеток с использованием иммунофлуоресцентного анализа показал неравномерность встраивания этого белка в индивидуальные ядерные поры. При этом в состаренных in vitro фибробластах человека ядерные поры нормальной морфологии в составе ядерной оболочки расположены достаточно равномерно, в количестве 10-12 комплексов пор на мкм2. 2) Получены плазмиды для анализа межмолекулярных взаимодействий в составе интерфазных проядрышек (ECFP-NPM1 и FBL-EYFP). Проанализированы взаимодействия между NPM1 и FBL на ранних этапах формирования проядрышек, когда эти два белка колокализуются на уровне световой микроскопии. Показано, что GAR-домен фибрилларина накапливается в части проядрышка, содержащей NPM1, а не FBL. 3) Проведен систематический поиск веществ, обладающих анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом. В ходе скрининга из возможных кандидатов выбраны два вещества - TR100 и ATM-3507. Созданы экспериментальные модели восьми культивируемых in vitro опухолевых клеток человека (нейробластом линий CHLA-20, CHLA-90, SK-N-BE(2), SK-N-SH, SH-SY5Y, CHP-134, SKMEL-28 и PC3). Анализ взаимодействия клеток перечисленных линий с веществами, обладающиим анти-тропомиозиновым (ATM-3507 и TR100) и анти-микротрубочковым (винкристин и винбластин) эффектом, позволил выбрать для дальнейших исследований модели, в которых эти вещества действуют синергично. На модели клеток CHLA-20 показано, что оба антитропомиозиновых вещества в сочетании с винкристином блокируют митотическое деление клеток в фазе G2 – M, что происходит из-за нарушений формирования нормального митотического веретена и приводит апоптозу.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
2 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: 1) Проведено электронно-микроскопическое исследование 30 образцов тестикулярной ткани мужчин с различными формами азооспермии (отсутствие сперматозоидов). Прослежены морфологические изменения структуры хроматина при репрограммировании. В пахитенных сперматоцитах выявлены структуры контакта мейотических хромосом и ядерной оболочки. Выявлены ранее не описанные в тестикулярной ткани аномалии базальной мембраны семенных канальцев. 2) Сравнительный анализ динамики микротрубочек (МТ) в различных областях распластанной клетки показал, что процессивность роста МТ от центросомы, в ламелле клетки и на краю клетки различается. Максимальная процессивность роста МТ наблюдается в глубине ламеллы клетки. Исследование дозо-зависимого эффекта ингибиторов микротрубочек на клеточную подвижность и на динамическую нестабильность +концов микротрубочек позволило определить концентрации ингибиторов микротрубочек (нокодазол и таксол), приводящие к видимому снижению подвижности клетки и замедлению роста микротрубочек. В случае нокодазола минимальная концентрация, подавляющая рост микротрубочек составляет 100 нМ. Предварительные данные показывают, что подвижность клеток снижается незначительно. В случае таксола полного ингибирования динамики микротрубочек не наступает, однако подвижность клеток заметно подавляется при концентрации 200-300 нМ. | ||
3 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: Исследована динамика разборки интерфазных проядрышек и роли РНК в их формировании. Интерфазные проядрышки формируются после возврата клеток из гипотонических в изотонические условия из материала частично разобранных ядрышек. Показано, что основным типом подвижности проядрышек является ограниченная диффузия. Выявлены отдельные случаи направленного движения телец, но эти движения (1) не зависели от ядерной актомиоиновой системы и (2) не были направлены по направлению к ядрышкам. Хотя проядрышки способны сливаться друг с другом, слияния с ядрышками крайне редки и наблюдаются только на ранних сроках. Продемонстрировано, что подвижность проядрышек ограничена гетерохроматином. Таким образом, доказано, что процесс восстановления структуры ядрышка не определяется переносом материала в составе проядрышек. Разборка проядрышек происходит путем постепенного ухода накопленных ядрышковых белков. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ изучен процессинг пре-рРНК в проядрышках. Показано, что уход из проядрышек созревших рРНК является движущей силой разборки этих телец. Также продемонстрировано, что концентрация ядрышковых белков в нуклеоплазме влияет на динамику разборки проядрышек – увеличение концентрации тормозит разборку, уменьшение – ускоряет. Исследована экстракция гистона Н1 полиглутаминовой кислотой (ПГ) из интерфазных ядер с разными Mg-зависимыми уровнями упаковки хроматина и влияние на неё дистамицина А. Найдена зависимость экстракции H1 от концентрации ионов Mg. Обнаружены фракции гистона Н1, доступность к экстракции которых зависит от уровня конденсации хроматина. Дистамицин А, преимущественно связывающийся с АТ-богатой ДНК, увеличивает экстракцию гистона Н1, но даже в насыщающей концентрации в присутствии ионов Mg не более чем на 25%. При этом по результатам исследования кругового дихроизма взаимодействие дистамицина с ядерным хроматином зависит от уровня упаковки хроматина. Изучена ультpаcтpуктуpа пигментного эпителия полевки Бpандта, гpызуна c дневным типом cуточной активноcти, cоотноcительно c извеcтными пpоцеccами, пpоиcxодящими в пигментном эпителии: 1) поcтуплением отделенныx от фотоpецептоpныx мембpан наpужныx cегментов и 2)пеpеваpиванием иx в фагоcомаx пигментного эпителия. Для выявления миелоидныx тел была иcпользована фаза cмены cветового pежима: cветовой (200 лк, 4 ч) на темновую (0,1 лк,1,5 ч). В цитоплазме пигментного эпителия полевки миелоидные тела не были найдены, однако были обнаpужены так называемые ламелляpные включения, котоpые по cвоим pазмеpам отличаютcя от миелоидныx тел. Выявлено наличие cтpуктуp, пpедположительно отвечающиx за тpанcпоpт пеpеpаботанного матеpиала. В пользу этого cвидетельcтвует пpиcутcтвие в апикальныx отpоcткаx: 1) пигментного эпителия пузыpьков c плотным, зеpниcтым cодеpжимым и 2) микpотpубочек, оcущеcтвляющиx тpанcпоpт «гpуза» в клеткаx. Исследованы изменения цитоскелета эндотелиальных клеток от момента распластывания и образования первых межклеточных контактов до формирования конфлюэнтного монослоя. Показано, что (1) в клетках венозного эндотелия экспрессируются две основные немышечные изоформы актина — β- и γ-цитоплазматические актины; (2)структурно система актиновых филаментов организована в виде кортикальной сети актина и пучков актиновых стресс-фибрилл; (3) исследование системы актиновых филаментов с помощью мечения специфическими антителами показало, что кортикальная и ламеллярная сеть состоят из γ-актина, в то время как пучки актиновых стресс-фибрилл состоят из β-актина. Формирование эндотелиального монослоя сопровождалось изменениями в системе микротрубочек: их количество увеличивалось на краю клетки, причем количество микротрубочек в районе уже сформированных межклеточных контактов всегда было выше, чем в области свободной ламеллы клетки. Анализ подвижности клеток при использовании различных доз ингибиторов микротрубочек показал, что скорость выползания фибробластов в экспериментальную рану уменьшается дозо-зависимым образом при воздействии нокодазола, винорельбина и таксола в наномолярных концентрациях. Пороговая доза, достоверно замедляющая движение клеток, для каждого ингибитора составляет 10 нМ, при концентрациях 50-300 нМ эффект выходит на плато. Поведение отдельных клеток существенно изменяется при переходе от 10 нМ к 30 нМ каждого ингибитора. Динамика микротрубочек, которая исследовалась методом временной трансфекции плюс-концевыми белками, оказалась клетках менее чувствительна к воздействию ингибиторов – видимые эффекты нарушения сети микротрубочек проявляются только начиная с концентраций 50-100 нМ, а стабилизация (частичное подавление роста) микротрубочек происходит при концентрациях не менее 300 нМ. Наиболее сильный эффект на стабилизацию микротрубочек оказывает винорельбин, наиболее слабый – таксол. Даже микромолярные концентрации таксола не приводят к полной стабилизации микротрубочек. Предварительные данные показывают, что в условиях частичной стабилизации микротрубочек нокодазолом, таксолом или винорельбином происходит пространственная дезорганизация их системы в эндоплазме клеток. Показано, что жизнеспособность сперматозоидов in vitro зависит от температуры инкубации. Полученные данные свидетельствуют о том, что инубируемые при 37оС сперматозоиды погибают по апоптотическому пути. Жизнеспособность сперматозоидов повышается при добавлении митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1. Исследовано влияние семенной жидкости на жизнеспособность сперматозоидов. Проводили измерение жизнеспособности сперматозоидов в нативном эякуляте и очищенных сперматозоидов в спермосохраняющей среде Спермопреп. Показано, что отделение сперматозоидов от семенной жидкости не меняет закономерности снижения жизнеспособности, т.е. индукция гибели сперматозоидов является внутренним свойством каждого индивидуального образца. | ||
4 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: С помощью методов широкопольной и конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии, а также флуоресцентной микроскопии с суперразрешением (SIM/STROM), охарактеризован эффект нокаута β- или γ-актина на организацию и морфологию системы микротрубочек в интерфазных и митотических клетках различной тканевой принадлежности in vitro. Исследованы особенности компактизации ДНК и прогрессии репликации хромосом клеток млекопитающих. Показано, что репликация ДНК эукаоритот протекает в контексте плотно упакованной хроматиновой матрицы, прежставленной и в эу-, и в гетерохроматиновых доменах фибриллами высшего порядка. Исследованы взаимодействия хроматина с ядерной ламиной при локальной даун-регуляции ламинов А и B-типа. На модели ядерных почек показано, что сборка микродоменов ламина В опосредована взаимодействием гетерохроматина с ядерной оболочкой. Изучена структурная организация интерфазных проядрышек в клетках HeLa с использованием методов световой и электронной микроскопии, выяснена роль гетерохроматина в качестве фактора,ограничивающего подвижность ядерных телец. На световом уровне, с помощью конфокальной микроскопии, изучена локализация химерного (слитого с tagRFP) фибрилларина после инкубации клеток в присутствии ингибитора метилтрансфераз (Adox). Кроме того, исследована ультраструктура ядрышка клеток инкубированных с Adox. Создана постоянная культура клеток 3Т3 трансфецированных плюс-концевым белком ЕВ-3 - RFP. Проведен анализ подвижности раковых клеток (А549, НТ1080) при ингибировании динамики микротрубочек. Предполагается сравнить эффекты воздействия нокодазола, винорельбина и таксола в наномолярных концентрациях на опухолевые клетки и сопоставить эти эффекты с поведением нормальных клеток. Изучена ультраструктура клеток репродуктивной системы человека и создана база данных по количественному исследованию органоидов сперматозоидов фертильных мужчин (структура ядра, производного комплекса Гольджи - акросомы, митохондрий, аксонемы и периаксонемных структур жгутика). Проведено количественное электронно-микроскопическое изучение 50 образцов сперматозоидов. | ||
5 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: Разработана схема анализа целостности генома сперматозоидов человека при помощи автоматизированной мироскопической цитометрии препаратов, окрашенных по методу TUNEL. Благодаря высокой воспроизводимости результатов и хорошей корреляции с другими методами анализа, данная процедура может быть рекомендована для применения в клинической практике. Исследованы ультраструктурные особенности упаковки ДНК некоторых крупнохромосомных видов высших растений в митозе. Полученные данные свидетельствуют об иерархической укладке высших уровней организации хроматина в интерфазных и митотических хромосомах растений. В геномах D.rerio и M.musculus обнаружены сайты персистирующих разрывов ДНК, ассоциированных с интерстициальными теломерными повторами, показано их тканеспецифичное распределение и динамика в ходе индивидуального развития. Исследованы взаимодействия суперпарамагнитных наночастиц карбида железа Fe7C3, инкапсулированных в углеродные оболочки, с живыми клетками как нетрансформированных, так и раковых линий in vitro при нормальных условиях и в условиях воздействия постоянного магнитного поля, взаимодействия суперпарамагнитных наночастиц карбида железа Fe7C3 с различными тканями животных in vivo, а также эффекты взаимодействия суперпарамагнитных наночастиц карбида железа Fe7C3 с тканями животных в условиях воздействия постоянного магнитного поля. С использованием постоянной культуры клеток 3Т3, трансфецированных плюс-концевым белком ЕВ-3 –RFP, проведен анализ ответа индивидуальных клеток на наномолярные концентрации ингибиторов микротрубочек (нокодазол, винорельбин, таксол) и исследована динамика роста индивидуальных микротрубочек и поведения «комет» из плюс-концевых белков с использованием высокоскоростной флуоресцентной микроскопии и реконструкции изображений. Проведено ультраструктурное изучение топологии фибриллы хроматина в блоках прицентромерного гетерохроматина в ядрах клеток мыши (хромоцентров) методом корреляционной световой и электронной микроскопии клеток, подвергнутых гипотонической деконденсации хроматина и возврату в изотонические условия на фоне воздействия 5-азацитидина и трихостатина-А. Получены новые данные о параметрах упаковки хроматина в гетерохроматиновых блоках и о механизмах поддержания компактизации этих ядерных доменов. Также при помощи репликативного мечения поздно-реплицирующейся фракции хроматина в комбинации с микроскопией структурированного освещения и иммуноэлектронной микроскопией обнаружена интерфазная сегрегация сестринских хроматид в хромоцентрах мыши, коррелирующая со сниженной концентрации белков когезии в данных доменах по сравнению с рано-реплицирующимся эухроматином. Исследована экспрессия сплайс-изоформ белка ядерной оболочки ламина А, в том числе маркера генетического старения клетки прогерина, в клетках пациентов различного возраста. Обнаружена положительная корреляция между возрастом пациента и концентрацией аберрантно сплайсированной мРНК ламина А, кодирующей прогерин, в клетках крови. Методами иммуноцитохимии изучена внутриклеточная экспрессия и локализация изоформ ламина А в различных тканях и опухолях разной степени прогрессии. | ||
6 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: Проведено сравнительное исследование действия противоопухолевых антибиотиков дистамицина и хромомицина на термодинамические параметры хроматина непосредственно в изолированных интерфазных ядрах эукариот в зависимости от уровня его компактизации разными неорганическими и органическими катионами. Для этого использованы методы дифференциальной сканирующей калориметрии и изотермической калориметрии в сочетании с методом электронной микроскопии. Проведено изучение ультраструктуры половых клеток человека при генетически обусловленных формах спермопатологии и определены частоты генетически обусловленных форм сермопатологии в Российской популяции. Определена распространенность отдельных форм генетически обусловленных форм спермопатологии в связи с возможностью генетических рисков при применении вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО/ИКСИ). Исследован процесс ремоделирования хроматина в сперматидах. Данное исследование включает анализ замещения гистоновых белков на протамины с помощью метода иммуноголдинга. На модели клеточной линии HeLa с нокдауном B23 исследована роль белка нуклеофозмина (B23) в созревании рибосомной РНК и влияние на общий уровень синтеза белка в клетке. | ||
7 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: 1) Анализ расположения слитого с GFP белка - нуклеопорина POM-121 в составе ядерной оболочки при транзитной трансфекции клеток с использованием иммунофлуоресцентного анализа показал неравномерность встраивания этого белка в индивидуальные ядерные поры. При этом в состаренных in vitro фибробластах человека ядерные поры нормальной морфологии в составе ядерной оболочки расположены достаточно равномерно, в количестве 10-12 комплексов пор на мкм2. 2) Получены плазмиды для анализа межмолекулярных взаимодействий в составе интерфазных проядрышек (ECFP-NPM1 и FBL-EYFP). Проанализированы взаимодействия между NPM1 и FBL на ранних этапах формирования проядрышек, когда эти два белка колокализуются на уровне световой микроскопии. Показано, что GAR-домен фибрилларина накапливается в части проядрышка, содержащей NPM1, а не FBL. 3) Проведен систематический поиск веществ, обладающих анти-тропомиозиновым и анти-микротрубочковым эффектом. В ходе скрининга из возможных кандидатов выбраны два вещества - TR100 и ATM-3507. Созданы экспериментальные модели восьми культивируемых in vitro опухолевых клеток человека (нейробластом линий CHLA-20, CHLA-90, SK-N-BE(2), SK-N-SH, SH-SY5Y, CHP-134, SKMEL-28 и PC3). Анализ взаимодействия клеток перечисленных линий с веществами, обладающиим анти-тропомиозиновым (ATM-3507 и TR100) и анти-микротрубочковым (винкристин и винбластин) эффектом, позволил выбрать для дальнейших исследований модели, в которых эти вещества действуют синергично. На модели клеток CHLA-20 показано, что оба антитропомиозиновых вещества в сочетании с винкристином блокируют митотическое деление клеток в фазе G2 – M, что происходит из-за нарушений формирования нормального митотического веретена и приводит апоптозу. | ||
8 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: В текущем году были проведены исследования взаимодействия новой системы доставки антибиотика с замедленным высвобождением на основе полимеров циклодекстрина на клетки бактерий. Показано, что предложенная форма обладает пролонгированным антибактериальным действием по сравнению с чистым антибиотиком. Проведены ультраструктурные исследования бактериальных клеток на предмет взаимодействия частиц изучаемого комплекса с клеточными стенками. Проведены исследования влияния летальных и сублетальных мутаций шаперонов тубулина человека на ультраструктуру клеток соединительной ткани и скелетной мускулатуры на клиническом материале. Выявлена дезорганизация сократимого аппарата мышечных клеток, сопряженная с аномальной реорганизацией хроматина в ядрах миоцитов. Значительных изменений в клетках соединительной ткани на ультраструктурном уровне не обнаружено. Проведен систематический анализ эффектов, лежащих в основе таргетного действия разных классов противоопухолевых препаратов, используемых в клинике (доксорубицин, винкристин, таксол). В качестве модельных линий использовали клетки наиболее распространенных опухолей: рака молочной железы (4T1), рака простаты (22rv1), рака толстой кишки (СT26), меланомы (В16). Стандартными микроскопическими методами исследованы цитофизиологические эффекты, характерные для действия различных противоопухолевых препаратов: (1) пролиферативная активность клеток; (2) апоптотический индекс; (3) митотический индекс; (4) наличие многополюсных митозов; (5) наличие ана- и телофаз в препарате. Методом 3D-SIM-микроскопии с последующей объемной реконструкцией полученных изображений на выбранных клеточных линиях исследованы нарушения, вызываемые противоопухолевыми препаратами, широко используемые в клинике (доксорубицин, винбластин, винкристин, паклитаксел (таксол)). Проведенные исследования показали, что реакция опухолевых клеток на воздействие противоопухолевых препаратов, обладающих разным механизмом действия различается и зависит от их тканевой принадлежности. Результаты электронно-микроскопического и иммуноцитохимического исследования клеток семенных канальцев половозрелых крыс с экспериментально моделированным метаболическим синдромом показали активацию процессов фагоцитоза и аутофагии в клетках Сертоли, а также процесса аутофагии в первичных сперматоцитах, округлых и вытянутых сперматидах. Активация аутофагии может быть важной частью обеспечения жизнеспособности клеток Сертоли и поддержки жизнеспособности половых клеток в стрессовых ситуациях, в том числе и при метаболическом синдроме. Известно, что аутофагия запускается в гипертермических условиях, при которых она действует как первичный цитопротекторный механизм, предотвращая накопление белковых агрегатов и повреждая органеллы, образующиеся в клетках, подвергшихся тепловому шоку. Описано повышение содержания маркеров аутофагии у пациентов с варикоцеле, где гипертермия считается основным фактором патогенеза (Foroozan- Broojeni и соавт.,2019). Электронно-микроскопическое изучение половых клеток пациентов с варикоцеле позволило обнаружить аутофагосомные вакуоли, что может быть морфологическим маркером нарушения фертилизационного потенциала сперматозоидов. На основе данных масс-спектрометрии и субдифракционной микроскопии обнаружено, что повышенные температуры могут вызывать “захват» основных факторов репарации ДНК хроматином, что может повышать чувствительность раковых клеток к терапевтическим средствам, направленным на повреждение ДНК. В частности, гипертермия может ингибировать созревание фрагментов Окадзаки и активировать соответствующий поли- (АДФ-рибоза)-полимеразный ответ на повреждение ДНК. Исследовали феномен интеграции сигналов ядерной и сигналов ядрышковой локализации (NLS и NoLS) с составе различных доменов белков. Биоинформатический анализ показал, что в белках современных эукариот NLS могут быть составной частью ДНК-связывающих доменов, при этом динамика их эволюции не отличается от эволюции домена в целом. Этот феномен мы назвали интеграцией NLS. Мы предполагаем, что такая интеграция связана с тем, что NLS - очень короткие мотивы, обогащенные положительно заряженными аминокислотами. С высокой вероятностью любой нуклеотид-связывающий домен может случайным образом содержать такие последовательности аминокислот. Эти наблюдения косвенно свидетельствуют о том, что NLS может быть интегрирован в состав ДНК-связывающих доменов. Если это так, то такие сигналы должны присутствовать и в составе ДНК-связывающих доменов прокариот. Экспрессия клонированных белков прокариот подтвердила, что во многих из них присутствуют мотивы, которые функционируют в качестве NLS при экспрессии белков в клетках человека (т.е. в контексте эукариотической клетки). Можно предположить, что такие NLS свяллись своеобразной преадаптацией, на основе которой началась эволюция одного из компонентов системы ядерного импорта. Интересно, что NLS предсказываются и в составе цитоплазматических белков, что также может быть связано с интеграцией сигналов в состав различных функциональных доменов. Наконец, мы обнаружили и детально изучили случай, когда ни один из доменов прокариотического белка не содержит NLS. Логично предположить, что в этом случае может происходить либо модификация одного из доменов, либо приобретение нового домена. Пример первого механизма описан в литературе для рибосомных белков (Melnikov et al., 2015). Мы провели анализ консервативных белков и обратили внимание на метилтрансферазу фибрилларин. Этот белок демонстрирует выдающийся консерватизм от архей до человека. Единственным отличием белков из эукариот является наличие дополнительного домена на N-конце белка, который, как можно было предположить, и адаптировал белок к эукариотической клетке. Действительно, мы показали, что этот домен содержит NLS, т.е. приобретение данного домена необходимо, в том числе, и для накопления белка в ядре. | ||
9 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: Исследована роль основного домена (BD) белка Tat вируса иммунодефицита человека в качестве сигнала ядерной и ядрышковой локализации. Методами молекулярного докинга идентифицированы участки BD, участвующие во взаимодействии с импортином альфа. Изучено антибактериальное действие наночастиц, полученных полимеризацией производных бета-циклодекстрина в присутствии антибиотика моксифлоксацина. С помощью зондовой микроскопии были исследованы клетки линии HT1080, а также трансгенные линии с мутациями ламина А R249Q и R527P и гиперэкспрессией нормального ламина А Исследованы ультраструктурные особенности сперматозоидов пациентов с первичной цилиарной дискинезией. Проанализированы различия в динамике микротрубочек в фибробластах пациентов с болезнью Гентингтона и здоровых доноров | ||
10 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: Анализ поведения клеток в процессе распластывания и движения по субстрату, а также при выползании в экспериментальную рану, позволил выявить фенотипические различия в поведении мутантных клеток и очертить круг потенциальных внутриклеточных нарушений для дальнейшего микроскопического анализа. В основе первичной цилиарной дискенезии лежит дефект ультраструктуры аксонемы ресничек эпителия респираторного тракта и аналогичных им структур, что приводит к нарушению их двигательной функции. Методом электронно-микроскопической томографии показано наличие или двух типов хроматиновых фибрилл или фибриллы переменного диаметра в пределах 150-180 нм, что согласуется с хромонемной моделью организации генетического аппарата позвоночных. | ||
11 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Выяснение общих принципов структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот |
Результаты этапа: 1) Глобулозооспермия – генетически обусловленное заболевание, для которой характерна сферическая форма головок сперматозоидов с первичным отсутствием акросомы и, очень часто, нарушенной конденсацией хроматина. При нормальном спермиогенезе ядерные поры и ламин В1 ядерной ламины сдвигаются к апикальному полюсу ядра. В сперматозоидах пациентов с глобулозооспермией выявлено аномальное распределение ламина В1 ядерной ламины, сохраняющейся по всей периферии ядра. Ламин А и его измененная форма – прогерин не были обнаружены. Обнаружено аномальное для сперматозоидов сохранение ядерных пор в ядерной оболочке вне зависимости от степени конденсации хроматина. Сохранение ядерной ламины морфологически выражено в наличии перихроматинового пространства в сперматозоидах как с незрелым, так и с конденсированным хроматином. Сохранение ядерных пор обнаружено как при классической форме заболевания при тотальном поражении сперматозоидов, так и при атипичной форме при содержании глобулярных сперматозоидов менее 50%, в сперматозоидах вытянутой формой головки. Полноэкзомное секвенирование выявило мутации с неизвестной клинической значимостью в генах DPY19L2 и SPATA16 у пациентов с атипичной глобулозооспермией; 2) Методами прижизненных наблюдений и микроскопии сверхвысокого разрешения (SIM –микроскопия) исследованы особенности функционирования тубулинового цитоскелета и характера взаимодействия клеток с субстратом на in vitro-моделях болезни Геттингтона на основе культивируемых in vitro человеческих фибробластов, полученных из биопсийного материала кожи пациентов, страдающих (1) классической (42 и 40 повторов CAG в гене HTT) и (2) ювенильной формами (76 повторов CAG в гене HTT) болезни Гентингтона. Анализ динамики микротрубочек и общей архитектуры их сети в цитоплазме позволил выявить фенотипические различия, характерные для мутантных клеток, а также зависимость выявленных нарушений от количества повторов, и очертить круг потенциальных внутриклеточных нарушений для дальнейших исследований; 3) разработан биоинформатический способ выявления белков нуклеоплазминового семейства на основе N-концевого (олигомеризационного) домена. Получены данные, которые полностью меняют сложившиеся взгляды на эволюцию белков этого семейства. Мы обнаружили, что С-концевой домен присутствовал в NPM-like белке еще у хоанофлагеллят, но был позднее потерян у Ecdysozoa. Причем, если у насекомых просто отсутствует С-концевой домен, то у круглых червей нам не удалось найти признаков присутствия генов белков нуклеоплазминового семейства. 4) Проведен анализ структуры ядрышка у представителей разных групп с использованием электронной микроскопии. Часть образцов было получено от коллег, часть зафиксировано нами. Ядрышко у всех животных, начиная с хоанофлагеллят и до рептилий, имеют относительно простую организацию, представляя собой скопление прерибосом. У рептилий структура ядрышка усложняется, но это усложнение не коррелирует с известными изменениями в структуре ядрышка. 5) Проведен функциональный анализ NPM1 и его С-концевого домена с использованием системы knockdown-rescue. Получены клеточные линии с нокдауном NPM1, а на их основе новые линии с экспрессией полноразмерного белка, белка без С-концевого домена и белка с мутациями, препятствующими олигомеризации белка. Показано, что нокдаун NPM1 ведет к торможению роста и частичной деконденсации гранулярного компонента. При этом такой нокдаун не влиял на процессы ассоциации ядрышек, для анализа чего были получены отдельные линии клеток HCT116 с нокдауном NPM1. Подготовлены заливки для электронной микроскопии. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".