Стабилизация люциферазы светляков L. mingrelica методами направленного и случайного мутагенеза

Кокшаров, М.И.; Угарова, Н.Н.

Авторы: Кокшаров М.И., Угарова Н.Н.
Сборник: Материалы VI Съезда Российского фотобиологического общества
Том: 1
Тезисы
Год издания: 2011
Место издания: НИА-Природа Москва Москва
Первая страница: 111
Последняя страница: 111
Аннотация: Люцифераза светляков катализирует биолюминесцентную реакцию окисления люциферина кислородом воздуха в присутствии АТФ и Mg2+. Благодаря высокой каталитической активности, специфичности к АТФ и простоте регистрации биолюминесцентного сигнала люцифераза светляков применяется в АТФ-метрии, в том числе для определения бактериальных загрязнений различных объектов, используется в качестве гена-маркера экспрессии и в пиросеквенировании. Люцифераза является перспективным инструментом для использования в качестве молекулярного сенсора для определения различных аналитов и изучения белок-белковых взаимодействий, а также в качестве метки в иммуноанализе. Применение нативных люцифераз светляков часто ограничивается их низкой стабильностью при повышенных температурах. В частности, люцифераза светляков Luciola mingrelica дикого типа (WT) при 37˚C теряет более половины активности за 50 минут. На основе анализа пространственной структуры люциферазы L. mingrelica были выбраны положения для внесения аминокислотных замен. Двойной мутант G216N/A217L был при 42°C в 18 раз стабильнее люциферазы дикого типа, но его активность составила только 10% от исходной, а максимум спектра биолюминесценции сместился от 566 до 611 нм. Внесение дополнительной замены S398M позволило получить тройной мутант G216N/A217L/S398M, сохранявший как высокую термостабильность двойного мутанта, так и высокую каталитическую активность, и спектры биолюминесценции, близкие к наблюдаемым для WT-люциферазы. В случае люцифераз лёгкость детекции биолюминесценции значительно упрощает процедуру скрининга библиотек мутантов по активности, что позволяет эффективно использовать метод случайного мутагенеза для направленного изменения свойств фермента. Было проведено четыре последовательных цикла случайного мутагенеза и скрининга для отбора мутантов с повышенной термостабильностью. В качестве начальной формы был выбран мутант S118C. Наиболее стабильный мутант, полученный в каждом цикле, был использован в качестве исходной формы для следующего. Применяемая методика скрининга мутантов по термостабильности не приводила к гибели клеток E. coli, что позволило проводить отбор термостабильных мутантов in vivo непосредственно на основе библиотеки колоний E. coli, без использования дополнительных реплик. В результате четырёх циклов мутагенеза был получен мутант 4TS, содержащий 8 замен по сравнению с WT-люциферазой. Стабильность мутанта 4TS при 42°C возросла в 65 раз по сравнению с WT-люциферазой (время полуинактивации увечилось с 8,5 минут до 10 часов), удельная активность возросла в 1.9 раза, Km по АТФ уменьшилась в 5,5 раз. Как правило, люциферазы жуков используются в диапазоне температур от комнатной до 37°C. Мутант 4TS через 2 суток сохраняет 70% активности при 37°C, т. е. его стабильность достаточна для большинства практических применений in vivo и in vitro.
Добавил в систему: Кокшаров Михаил Иванович

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИПМех РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИПМех РАН

Стабилизация люциферазы светляков L. mingrelica методами направленного и случайного мутагенезатезисы доклада

Прикрепленные файлы