Аннотация:Люцифераза светляков катализирует окисление D-люциферина кислородом воздуха в присутствии АТР и ионов магния, которое сопровождается биолюминесценцией в области 450 - 600 нм. В нашей лаборатории получены различные мутантные формы термостабильной люциферазы светляков Luciola mingrelica, отличающиеся по спектрам биолюминесценции, которые успешно применены в качестве высокочувствительных белковых маркеров для изучения специфических межмолекулярных взаимодействий в методах молекулярнойдиагностики. Достоинством биолюминесцентных систем является отсутствие фонового сигнала и простота детекции - они не требуют источника возбуждающего излучения. Использование термостабильной люциферазы дает возможность проводить исследования при 37°С и выше без изменения активности фермента внутри и вне клеток в течение длительного времени, что открывает большие возможности для работы с живыми клетками. Люцифераза как маркер внутриклеточных процессов. Тест-системы на основе живых прокариотических и эукариотических клеток, продуцирующих термостабильную люциферазу светляков, могут быть использованы для изучения любых внешних факторов физической и химической природы, влияющих на их функционирование. Биолюминесцентные клетки позволяют регистрировать начальные стадии изменения проницаемости клеточной мембраны и оценивать степень повреждения клеток в присутствии мембраноактивных соединений, что является одним из критериев их жизнеспособности. Рекомбинантные клетки Escherichia coli, экспрессирующие люциферазу, использованы нами изучения влияния колистина -полипептидного поликатионного антибиотика полимиксинового ряда. Повреждение клеточной мембраны приводит к пропорциональному увеличению активности внеклеточной люциферазы (Aex). Остаточная концентрация живых клеток пропорциональна активности фермента внутри клетки (Аin). Для изучения эффективности действия мембрано-активных сапонинов (дигитонина и его аналогов диосцина и протодиосцина) мы разработали тест-систему для непрерывной регистрации процесса пермеабилизации клеточной мембраны в режиме реального времени на основе клеток НЕК293, экспрессирующих люциферазу, по накоплению люциферазной активности (Aex). Показали, что литическая активность сапонинов зависит не только от концентрации агента и длительности инкубации, но и от его структуры - дигитонин, проявляет высокую литическую активность за счет образования комплексов с холестерином, что приводит к образованию пор. Однако, незначительные изменения структуры у его аналогов - уменьшение числа углеводных циклов в молекуле диосцина или наличие объемного заместителя в агликоновой части молекулы протодиосцина приводит к резкому снижению их литической активности. Таким образом, разработанные тест-системы на основе живых клеток могут быть использованы для скрининга лекарственных средств и изучения механизма их действия. Люцифераза светляков как маркер в биолюминесцентном иммуноанализе. Мы разработали универсальный метод получения высокоактивных, стабильных и функционально активных конъюгатов термостабильной люциферазы с биоспецифичными белками (альбумином, авидином из куриных яиц и антителами) и продемонстрировали возможности их использования в различных схемах иммуноферментного анализа. Для этого к поверхностным SH-группам остатков цистеина люциферазы присоединяли целевые белки с использованием гетеробифункционального сшивающего агента - N-сукцинимидил -3-(2-пиридилдитио)-пропионата (SPDP), специфичного к SH-группам люциферазы и NH2-группам белка. Наличие спейсера между конъюгированными белками и удаленность точек пришивки от активного центра позволило сохранить подвижность молекул, ферментативную активность и способность к аффинному связыванию. Полученные конъюгаты успешно апробированы в биолюминесцентном иммуноанализе. Так, конъюгат Luc-Alb использовали в конкурентном ИФА для детекции микроальбуминурии, что позволило регистрировать свободный альбумин в анализируемом образце в диапазоне концентраций от 5 до 300 мкг/мл. Конъюгат Luc-Avi является универсальной аффинной меткой, позволяющий выявлять любые биотинилированные макромолекулы, такие как биотинилированные вторичные антитела. Конъюгаты люциферазы с авидином и антителами использовали для иммуноферментного определения клеток Salmonella с пределом обнаружения клеток 5·104 КОЕ/мл. Для снижения предела обнаружения клеток Salmonella paratyphi A мы получили конъюгаты Luc-AntiSal и разработали псевдо-гомогенный биолюминесцентный иммуноферментный анализ бактериальных клеток с использованием новой матрицы для захвата аналита - микрочастиц полистирола, покрытых Pluronic F108-PDS, ковалентно меченных антителами Sal. Использование этой матрицы позволило эффективно улавливать анализируемые клетки сальмонеллы в растворе и их детектировать с пределом обнаружения 2,7 x 103 КОЕ/мл без предварительного концентрирования образца. Этот подход может быть использован для анализа бактериальных клеток в биологических образцах, продуктах питания и других анализируемых объектах.
